в какой цвет окрашивается белок при проведении с ним биуретовой реакции

ОПЫТ 1. Биуретовая реакция Пиотровского

При добавлении к щелочному раствору белка раствора сернокислой меди жидкость приобретает красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет. Реакция обусловлена присутствием в белке пептидных связей, которые с ионами меди образуют окрашенное комплексное соединение. В щелочной среде кетонная форма полипептида переходит в енольную.

Енольная форма полипептида взаимодействует со щелочным раствором медной соли с образованием так называемого биуретового комплекса.

Интенсивность окраски зависит от длинны пептида и варьирует от сине-фиолетовой до красно-фиолетовой. Положительную реакцию дают соединения, содержащие не менее двух пептидных связей.

В одну пробирку налить 2 мл раствора яичного белка, в другую столько же раствора желатина. Затем в каждую прибавить равный объем 10%-ного раствора едкого натра и по 2-3 капли 1%-ного раствора сернокислой меди СuSO₄. Проявляется красно-фиолетовое окрашивание.

ОПЫТ 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты

Эта реакция обусловлена присутствием в белке аминокислот, имеющих аминогруппу в α-положении.

Белки, пептиды и аминокислоты образуют с нингидрином соединение синего или сине-фиолетового цвета. α-Аминокислоты, реагируя с нингидрином, окисляются и распадаются с образованием аммиака, альдегида и углекислого газа. Нингидрин восстанавливается и конденсируется с другой молекулой нингидрина и аммиаком. В результате образуется сложное соединение, окрашенное в синий цвет /пурпурный Руэмана/.

Реакция может быть представлена следующим образом:

В одну пробирку налить 1-2 мл 1%-ного раствора глицина, в другую столько же раствора яичного белка. В обе пробирки добавить 0,1-ный спиртовый раствор нингидрина (в первую пробирку 5-6 капель, во вторую 10-12 капель) и нагревать около минуты. В пробирке с глицином быстро появляется сине-фиолетовое окрашивание. В пробирке с белком окраска более бледная красно-фиолетовая и развивается медленнее.

ОПЫТ 3. Ксантопротеиновая реакция на циклические аминокислоты

Ксантопротеиновая реакция характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). При нагревании белков, содержащих эти аминокислоты, с концентрированной азотной кислотой образуется соединение желтого цвета:

На второй стадии нитропроизводное реагирует с гидроксидом аммония с образованием аммонийной соли желто-оранжевого цвета.

Ксантопротеиновую реакцию, кроме белков, пептидов и циклических аминокислот, дают также многие простые ароматические соединения (бензол, фенол др.)

1. К 2 мл 0,1%-ного раствора фенола осторожно по стенке прилить 1-2 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно нагреть. Появляется желтое окрашивание.

2. В другую пробирку налить 2 мл яичного белка, прибавить 8-10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно нагреть. Выпадает осадок, который окрашивается в желтый цвет.

После охлаждения в пробирку осторожно по стенке приливают избыток концентрированного раствора аммиака. Жидкость приобретает желто-оранжевый цвет.

Реакцию проводят под тягой!

3. Те же реакции проводят с раствором желатина. Однако желтое окрашивание с ней не появляется, так как желатин не содержит ароматических аминокислот.

Источник

В какой цвет окрашивается белок при проведении с ним биуретовой реакции

Биуретовая реакция

Биуретовая реакция служит для обнаружения пептидных связей. Пептидная связь наиболее характерна для белков, и в этом смысле биуретовая реакция являемся наиболее специфичной. В белках возможны и другие связи, например, сульфидная, эфирная, солевая, водородная. Для обнаружения этих связей биуретовая реакция негодна.

Биуретовая реакция основана на том, что в щелочной среде (в присутствии гидроокиси натрия) при добавлении солей меди (медного купороса) полипептиды и белки образуют окрашенные комплексные соединения с ионом меди.

Хотя отдельные аминокислоты этой реакции не дают, но, как исключение, она возникает в присутствии аспарагина и гистидина.

Отрицательной чертой биуретовой реакции является то, что она малочувствительна. Окрашивание особенно хорошо проявляется только там, где белков много (например, в меристематических клетках).

Проведение биуретовой реакции на свежем материале может дать ослабленное окрашивание из-за слабой проницаемости тканей. Фиксированный материал дает в этом отношении лучшие результаты; однако надо иметь в виду, что фиксация спиртом неприемлема для спирторастворимых белков (как, например, белки зерновых злаков).

1) 7%-ный раствор медного купороса.

2) 30-50%-ный раствор гидроокиси натрия (или калия).

1. Погрузить срез в раствор медного купороса на 5-30 мин в часовом стекле.

2. Тщательно отсосать этот раствор фильтровальной бумагой и промыть срез водой до удаления голубой окраски из промывной воды.

3. Перенести срез на предметное стекло и обработать раствором гидроокиси натрия (или калия) от 10-20 мин до 1 ч.

4. Наблюдать появление фиолетовой окраски (иногда розовой в присутствии низкомолекулярных белков или полипептидов).

Результаты реакции (табл. 17)

Реакция не идет в паренхиме листа капусты и проявляется неярко в тканях пучка.

Эндосперм зерновки кукурузы не дает реакции, не считая алейронового слоя, где она проявляется, хотя и очень незначительно. Зародыш окрашивается ярко.

Источник

Цветные реакции на белки

Белок и всё о нём в биологии и химии < belok-s.narod.ru >

Цветные реакции на белки

Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ, идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных и приобретенных патологий обмена у новорожденных.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, 3 капли NaOH, 1 каплю Cu ( OH )₂, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) нингидрин, 0,5% водный р-р.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, затем 5 капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.

Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.

Реакция Адамкевича. Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

Реактивы: 1) неразбавленные яичный белок; 2) конц. (ледяная) уксусная к-та; 3) конц. серная к-та.

Ход определения. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной к-ты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной к-ты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

Ход определения. К 5 каплям р-ра белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин появляется черный или бурый осадок.

Источник

Лабораторная работа № 7 Свойства белков Цветные реакции на белки и аминокислоты.

Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, например, фенол, подобно тирозину, дает розово-красное окрашивание с реактивом Миллона, поэтому проведения одной какой-либо реакции для установления наличия белка не достаточно.

Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки); 2) специфические – только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот, например реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Миллона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин) и др.

При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:

Цветные реакции на белки (качественные реакции)

Что открывает данная реакция

Цветные реакции на белки Опыт 1. Биуретовая реакция.

Биуретовая реакция – качественная на все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза, которые содержат не менее двух пептидных связей.

Биуретовая реакция с глицином

Порядок выполнения работы.

К 1 мл исследуемого 1% раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) щелочи и затем 2-3 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO₄). разбавленного, почти бесцветного раствора медного купороса.

При положительной реакции появляется фиолетовая окраска с красным либо синим оттенком.

Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу».

Принцип метода. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка, прибавляют 2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь осторожно кипятят (чтобы смесь не выбросило).

При этом выделяется аммиак, который обнаруживается по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипении, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца).

При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца:

Pb(CH₃COO)₂ + 2NaOH Pb(OH)₂ + 2 CH₃COONa,

Pb(OH)₂ + 2NaOH Na₂PbO₂ + H₂O,

Na₂S + Na₂PbO₂ + 2H₂O PbS + 4NaOH.

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков.

Принцип метода. Эта реакция используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет. Желатин, например, не содержащий ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы.

Порядок выполнения работы.

К 1 мл 10 %-го раствора белка куриного яйца добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. В результате коагуляции белка в содержимом пробирки образуется белый осадок или помутнение. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется в результате гидролиза. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия (до появления оранжевой окраски раствора).

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:

нитропроизводное тирозина желтого цвета рН  7,0

хиноидное производное оранжево-желтого цвета рН > 7,0

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 4. Реакция Адамкевича (на присутствие в белках триптофана).

Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами глиоксиловой кислоты (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) с образованием окрашенных продуктов конденсации. Реакция протекает по уравнению:

Желатин не дает этой реакции, т.к. он не содержит триптофана. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси.

Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H₂SO_4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают несколько капель неразбавленного белка и прибавляют 2 мл. ледяной уксусной кислоты и несколько капель глиоксиловой кислоты. Смесь слегка нагревают до растворения образующегося осадка, охлаждают и, сильно наклонив пробирку, осторожно по стенке приливают концентрированную H₂SO₄ так, чтобы обе жидкости не смешивались.

Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 5. Нингидриновая реакция.

Принцип метода. a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция идет по схеме:

восстановленная форма нингидрина (гидриндантин)

продукт конденсации сине-фиолетового цвета

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.

Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином.

В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 1 мл 1-10%-го разбавленного раствора белка куриного яйца и 1-2 мл 1%-го раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки перемешивают и в течение 2-3 мин осторожно нагревают на водяной бане до появления сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующее о присутствии в белке α-аминокислот.

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 6. Реакция Сакагучи.

Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:

Порядок выполнения работы.

К 2 мл. 1%-го разбавленного раствора белка куриного яйца добавляют 2 мл. 10%-го гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Затем приливают 0,5 мл. гипобромита натрия (NaBrO) или гипохлорита натрия (натрий хлорноватистокислый – NaOCl), перемешивают. Тотчас появляется красное, постепенно усиливающееся окрашивание.

Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.

Эта реакция характерна для соединений, содержащих остаток гуанидина

NH = C –NH₂,

и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина:

NH = C –NH – (CH₂)₃ –CH –COOH

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Источник

ЦВЕТНЫЕ И ИМЕННЫЕ КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

История химии в школьном курсе

РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)

В белках аминокислоты связаны друг с другом по типу полипептидов и дикетопиперазинов. Образование полипептидов из аминокислот происходит путем отщепления молекулы воды от аминогруппы одной молекулы аминокислоты и карбоксильной группы другой молекулы:

Образующаяся группа –С(О)–NН– называется пептидной группой, связь С–N, соединяющая остатки млекул аминокислот, – пептидной связью.

При взаимодействии дипептида с новой молекулой аминокислоты получается трипептид и т. д.

Дикетопиперазины образуются при взаимодействии двух молекул аминокислот с отщеплением двух молекул воды:

Дикетопиперазины были выделены из белков Н.Д.Зелинским и В.С.Садиковым в 1923 г.

Наличие в белке повторяющихся пептидных групп подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного купороса в присутствии щелочи (биуретовая реакция).

Реакция идет по схеме:

Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

Описание опыта. В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда):

Это реакция на аминокислоту глицин.

В таких солях ион меди координационными связями соединен с аминогруппами.

Описание опыта. В пробирку наливают 3 мл 3%-го раствора сульфата меди(II), добавляют несколько капель 10%-го раствора гидроксида натрия до образования голубого осадка. К полученному осадку гидроксида меди(II) приливают 0,5 мл концентрированного раствора глицина. При этом образуется темно-синий раствор глицината меди:

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора тирозина и добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. Смесь нагревают до появления желтой окраски. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия до появления оранжевой окраски раствора:

Описание опыта. В пробирку наливают около

0,5 мл раствора уксуснокислого свинца и прибавляют раствор едкого кали до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. В другую пробирку наливают

Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:

По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.

В ходе проведенного исследования мы выявили по литературным источникам имеющуюся информацию о цветных качественных реакциях на белковые аминокислоты; выполнили ряд перечисленных реакций и составили базу данных. Эта база может быть использована в школьной практике как в теоретическом плане, так и в практическом, т. к. мы приводим краткие, но подробные описания выполнения всех опытов.

Из предложенных 18 качественных реакций каждая практически осуществима в школьном курсе химии и имеет важное практическое значение. Сопровождение реакций химическими уравнениями конкретизирует и углубляет знания по биологической и органической химии, особенно знания учащихся специализированных биологических и химических классов.

Использованная литература

Ермаков А.Н., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Мирри И.К. Методы биохимического исследования растений. М.,1952, 520 с.
Полянская А.С., Шевелева А.О. Методическая разработка по лабораторным работам: «Аминокислоты» и «Белки». Л., 1976, 37 с.
Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. 1999, 541 с.
Руководство к практическим занятиям по органической химии. Под ред. В.М.Родионова. М., 1954, 111 с.
Соловьев Н.А. Лабораторные работы по биологической химии. Методическая разработка. СПб., 1996, 70 с.
Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М., 1982, 311 с.

З.Саитов, С.В.Телешов, Б.Харитонцев,
секция «Юный химик» РХО им. Д.И.Менделеева (г. Тобольск)

Источник