что такое прямое окрашивание в гистологии

Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.).

Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.

Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем— цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.

Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Железный гематоксилин Гейденгайна

окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2—12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1—36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2—5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.

Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:

1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллированной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1—2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином.

Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 110-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время, от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Ниже описаны методики, и прописи красителей в частности гематоксилина и его приготовление для окраски срезов из книги Р. Лилли

ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ

ПРОТРАВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЯДЕР И ДРУГИХ СТРУКТУР

Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще лучше в кислых растворах. Многие авторы предпочитают перекрашивать срезы не подкисленными растворами красителя, а затем дифференцировать их в кислоте, подкисленном спирте или других дифференцирующих агентах.

Квасцовый гематоксилин, приготовленный на 10%-ном водном растворе алюмо-аммониевых квасцов, имеет рН около 2,95; при добавлении 2% уксусной кислоты рН сдвигается до 2,34, при добавлении 4% — до 2,22.

Отмечено, что содержание гематеина в различных партиях поступающего в продажу гематоксилина различно, так что краситель иногда может представлять собой почти чистый гематеин. У меня имелись образцы гематоксилина, которые «вызревали» «естественным путем» за сравнительно короткий срок (8—10 дней). Обычный срок вызревания составляет 8—10 недель, хотя, по данным Шморля, период вызревания для гематоксилина Бемера составляет 8—10 дней. Иногда встречаются партии гематоксилина, которые оказываются сильно «переокисленным» при добавлении стандартных количеств иодата натрия. Я могу привести пример, когда 1 г NaIО3 окисляли 6 г гематоксилина. Это соотношение ниже, чем в прописи Майера, но выше рекомендованного.

Хорошо «вызревшие» растворы квасцового гематоксилина разбавляют дистиллированной водой до концентрации приблизительно 10 мг гематоксилина в 1 л. При «переокислении»- независимо от того, достигнуто ли оно за счет длительного выдерживания на воздухе или избыточной дозы окислителя,— раствор меняет цвет от пурпурного через красный до оранжевого или даже желто-коричневого.

Для приготовления растворов гематоксилина с хорошими красящими свойствами на 1 г гематоксилина обычно берут 177 мг перманганата калия, 200 мг иодата натрия и 500 мг окиси ртути, но, как было показано недавно, количества некоторых из зтих окислителей можно уменьшить.

переокисленвые растворы гематоксилина при добавлении 30% глицерина восстанавливали при стоянии свою способность к окрашиванию.

В табл. 1 приведен ряд наиболее часто употребляемых прописей приготовления

квасцовых гематоксилинов из расчета на 1 л раствора. В некоторых методах рекомендуется сначала растворить гематоксилин в спирте или в воде и окислить либо на воздухе, либо добавляя окислители. По-видимому, не имеет значения, добавляются ли квасцы, глицерин, вода, уксусная кислота и другие компоненты к гематоксилину до или после его окисления; не важен и метод окисления. Спирт и глицерин могут сами окисляться химическими окислителями.

Пропись Делафильда цитируется по Майеру («Энциклопедия» Эрлиха).

Я беру 60 г квасцов, что несколько превышает количество, необходимое для получения раствора 1 : 11, который Майер считает насыщенным. Маллори советует применять 15%-ный раствор квасцов и во всех прописях использует этиловый спирт. Последняя рекомендация кажется полезной.

Прописи для приготовления 1 л квасцовых гематоксилинов

Источник

Что такое прямое окрашивание в гистологии

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Предметом изучения цитологии, гистологии и эмбриологии являются клеточно-тканевые структуры организмов на микроскопическом уровне, а предметом изучения – микроскопический препарат. Поэтому для успешного освоения этих наук необходимо владеть гистологической техникой – приемами и методами изготовления микроскопических препаратов и способами их изучения. В настоящем руководстве изложены основные сведения по технике гистологических исследований, оно знакомит студентов с правилами работы и методами наблюдения под микроскопом, методикой приготовления препаратов. Особое внимание уделено методам окрашивания различных клеточно-тканевых структур и гистохимическим исследованиям. Методики применимы на растительных и животных объектах.

Методические указания рекомендованы для студентов, специализирующихся по кафедре физиологии человека и животных, могут быть использованы на лабораторных занятиях по цитологии, гистологии и эмбриологии, большом практикуме, при выполнении курсовых и дипломных работ.

Автор: Газимагомедова И.К. – доц. каф. зоологии и физиологии, канд. биол. наук

Приготовление постоянного микротомного препарата Взятие и фиксация материала …………………………….

Уплотнение (заливка в парафин) ………………………….

Окрашивание и заключение в бальзам ………………….

Методы окрашивания гистологических препаратов …

Методы окраски клеток и неклеточных структур соединительной ткани ……………………………………..

Выявление элементов нервной системы

Приготовления препаратов давленных объектов. Методы изучения митоза и мейоза ………………………

1. Световая Микроскопия

1.1. Устройство микроскопа

В микроскопе различают оптическую (объектив, окуляр), осветительную (источник света, зеркало, конденсор и диафрагма) и механическую (штатив, предметный столик, колонка с макро- и микровинтами, тубус) части (рис. 1).

Рис.1. Световой микроскоп.

Полное увеличение микроскопа оценивают как произведение увеличений объектива и окуляра, например, при объективе 20 и окуляре 10 полное увеличение микроскопа будет 200 (20 10 = 200 раз).

Разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя видимыми точками (минимальный размер объекта):

где: λ – длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды (воздух или масло); α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив (максимально 90°); n ∙ sin α – апертура линз.

Если использовать ультрафиолетовый свет (260 – 280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13 – 0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемым волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу – это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 – 2500 раз. Это и есть “полезное” увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2–0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа (минимальное расстояние на котором различимы два объекта).

Зеркало собирает лучи от источника света и направляет их на препарат снизу. При искусственном освещении используется вогнутая поверхность зеркала, а при дневном – плоская.

Конденсор состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. При подъеме конденсора попадающие на препарат лучи рассеиваются, при опускании концентрируются на препарате, но на более ограниченном участке. Обычно работают при конденсоре, поднятом до уровня столика.

В итоге, световые лучи проходят следующий путь: источник света → зеркало → конденсор → диафрагма → препарат → объектив → тубус → окуляр. Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.

1.2. Техника микроскопирования

Изучить препарат при малом увеличении.

Перевести препарат на большое увеличение. Для этого сменяют объектив на 40 поворотом для револьвера. Медленно и осторожно опускают тубус почти до касания объективом покровного стекла (до образования узкой щели), чтобы не раздавить стекла. Медленно вращая микровинт на пол-оборота вперед или назад, достигается четкость изображения. На микровинт бывает надето кольцо с делениями, показывающими, на сколько микрон мы поднимаем или опускаем тубус. На левом барабанчике этого винта нанесено 50 делений, и каждое перемещение на одно деление соответствует 2 микронам. Эти деления также позволяют оценить толщину препарата и определить, на какой относительной глубине залегают те или иные структуры в срезе, например, каков слой цитоплазмы над или под ядром, каков размер последнего.

Для изучения очень мелких структур используют иммерсионный объектив ( 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионной среды (бывают масляные, водные, глицериновые), обычно кедровое масло, затем осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива с маслом. Четкость изображения регулируют микровинтом. После работы удаляют марлей иммерсионное масло с объектива и покровного стекла.

2. Приготовление постоянного микротомного препарата

Приготовление постоянных гистологических препаратов включает следующие этапы: 1) взятие и фиксация материала; 2) промывка и обезвоживание; 3) уплотнение (заливка в парафин); 4) приготовление срезов; 5) окрашивание; 6) обезвоживание и заключение препаратов в консервирующую среду (рис. 2).

2.1. Взятие и фиксация материала

Необходимое условие при взятии материала – сохранение прижизненной организации тканей. Для этого материал берут «живьем» и быстро убивают, обычно погружая в специальные фиксирующие жидкости, в целях сохранения витальной структуры, т.е. проводят фиксацию.

Рис. 2. Этапы приготовления гистологического препарата для световой микроскопии.

В зависимости от строения органа взятие материала осуществляется по-разному. Из однородных органов (печень, селезенка) кусочек можно вырезать из любого участка. Из неоднородных органов (почка, надпочечник) необходимо так вырезать кусочек, чтобы попали все слои. Величина кусочка зависит от структуры органа, целей исследования и способов дальнейшей обработки. Из соответствующего органа вырезают обычно небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см ).

Способы фиксации – использование фиксирующих жидкостей, криофиксация (мгновенное замораживание в жидком азоте) и лиофилизация (замораживание с последующим высушиванием в вакууме). При лиофилизации выпадает необходимость проводить обезвоживание и уплотнение материала.

Фиксирующие средства бывают простые и сложные. К первым относятся спирты, ацетон, кислоты, формалин, сулема, пикриновая кислота, тетраоксид осмия. Сложными являются смеси различных веществ, например жидкость Ценкера, жидкость Карнуа, жидкость Буэна и т.д. Так, для лучшей фиксации ядер употребляют хромовые или хромосмиевые смеси, для фиксации цитоплазмы смеси Карнуа или Буэна. Фиксирующие свойства зависят от рН среды, температуры, продолжительности фиксации.

В последнее время, особенно для электронной микроскопии, широко используется глютаровый альдегид, который более эффективно сшивает молекулы и тем самым обладает сильным фиксирующим действием.

Требования, предъявляемые к фиксатору : 1) свежесть; 2) достаточное количество. Объем фиксатора должен в 20-40 раз превышать объем фиксируемого материала, объект со всех сторон должен быть окружен фиксатором. Если часть материала плавает на поверхности фиксатора, то сверху накладывают тонкий слой ваты. Как до, так и после фиксации объект не должен подсыхать на воздухе.

100% или 96% спирт……………………6 частей

Ледяная уксусная кислота…………… 1 часть

Фиксатор готовят перед употреблением. Фиксируют от 30 мин до 3 ч, затем кусочки можно хранить в 70% спирте.

100% или 96% этиловый спирт………. 3 части

Продолжительность фиксации – 2-12 ч. Иногда в нем хранят материал при 0-3 о С.

Двухромовокислый калий………………2,5 г

Сернокислый натрий…………………….1 г

Дистиллированная вода…………………100 мл

Ледяная уксусная кислота………………5 мл (добавляют перед употреблением)

Фиксируют 1-24 ч. Затем 24 ч промывают в водопроводной воде до обесцвечивания воды. Материал обесцвечивают в 70% спирте, где его можно хранить. Цвет фиксатора – насыщенно красно-бордовый. Как только сулема будет удалена, раствор перестанет обесцвечиваться.

100% или 96% спирт…………………….10 мл

Ледяная уксусная кислота………………2 мл

Фиксируют от 5 мин и более. Фиксатор пригоден для приготовления временных давленых препаратов.

5% формалин: 1 часть 40% формалина + 7 частей дистиллированной воды.

10% формалин: 1 часть 40% формалина + 3 части дистиллированной воды.

20% формалин: 1 часть 40% формалина + 1 часть дистиллированной воды.

Методика проведения фиксации. Берется чистая стеклянная посуда (пробирки, бюксы или стаканчики) с фиксатором, объем которого в 20-40 раз больше объема материала. На дно посуды кладут гигроскопическую или стеклянную вату для равномерного пропитывания объекта. Материал с помощью пинцета быстро помещается в фиксирующую смесь (фиксатор должен быстро проникать в ткани и не вызывать грубых нарушений тканевых структур) и посуда плотно закрывается. Вместе с материал в пробирку кладется фиксационная этикетка, сделанная из плотной бумаги, размером 1х1 см, на которой простым карандашом отмечаются название изучаемого материала, фиксатора и дата фиксации.

Если ткань богата водой или кровью, фиксатор следует дважды сменить.

После фиксации образцы промывают проточной водой (в некоторых случаях спиртом) от 1 до 3 ч, иногда дольше. Промывкой материала удаляется излишнее количество фиксатора. В зависимости от способа фиксации существуют разные способы промывки. После фиксации в смеси с пикриновой кислотой промывка производится 70-80% спиртом. При фиксации в смесях, содержащих сулему, трихлоруксусную кислоту, используют 90-96% спирт. При формалиновой фиксации и фиксации хромовыми смесями промывку производят проточной водой под краном, или неоднократной сменой воды (10-12 раз) в течение 24-48 ч. Материал, фиксированный в смесях с преобладанием спирта (фиксатор Карнуа) промывке не подвергается.

Существуют разные приспособления для промывки: 1) обычные стеклянные склянки с пробкой или завязанные марлей и резиновым шлангом, соединенные с краном; 2) для мелких объектов применяются специальные фарфоровые сита; 3) стеклянные трубочки, обвязанные с обеих сторон марлей.

Удобно провести промывку материала следующим образом: материал вместе с этикеткой переносят в марлевые узелки, перевязывают их ниткой и помещают в высокий стакан с водой. Сверху в стакан кладут воронку и все ставят под кран с проточной водой.

Далее необходимо получить срезы материала для их последующего окрашивания. Для этого образцы уплотняют, т.е. заливают в парафин или целлоидин, чтобы в последующем их можно было тонко резать. Предварительно образцы обезвоживают, чтобы гидрофобный уплотнитель смог проникнуть в ткань. Обезвоживание производится проведением материала по батарее спиртов возрастающей концентрации, что позволяет избежать разрывов и деформаций ткани.

Методика обезвоживания. Материал вынимают из марлевых узелков и вместе с этикеткой последовательно помещают в стаканчики или бюксы со спиртами (метанол или этанол) возрастающей концентрации – 70%, 80%, 96%, 100%. Чем нежнее материал, тем ниже первоначальная концентрация спирта (начинают с 20% спирта). Время выдерживания в каждом спирте зависит от толщины материала и строения органа: от 30 мин, 1-6 ч, и до 6-12 ч. В 96% и 100% спиртах выдерживают дважды. При перекладывании материала из слабого раствора спирта в спирт большей концентрации кусочки необходимо обсушить фильтровальной бумагой.

Схема и сроки выдерживания в спиртах растительного материала:

Источник

• ← что такое браширование паркетной доски
• можно ли взять распечатку звонков за год мтс →