что такое праймер в биологии
Праймер
Примечания
См. также
Полезное
Смотреть что такое «Праймер» в других словарях:
праймер — сущ., кол во синонимов: 1 • феромон (16) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов
ПРАЙМЕР — (англ. primer), феромон, действие которого проявляется не сразу, а через определенный и необходимый промежуток времени (например, “царское вещество” пчел). Экологический энциклопедический словарь. Кишинев: Главная редакция Молдавской советской… … Экологический словарь
праймер — Короткая последовательность молекулы ДНК, использующаяся для инициации синтеза специфического фрагмента при полимеразной цепной реакции [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN primer … Справочник технического переводчика
Праймер — специальный дисперсионный лак, при помощи которого покрывают запечатанные слои обычных (традиционных) масляных офсетных красок, если предполагается нанести на слой этих красок слой УФ лака. П. служит буфером и разделяет слой краски от слоя лака,… … Реклама и полиграфия
праймер — poklijai statusas T sritis chemija apibrėžtis Suklijavimą gerinantis gruntas. atitikmenys: angl. primer rus. адгезионный грунт; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймер — pradmuo statusas T sritis chemija apibrėžtis Oligomeras, įeinantis į biopolimero sudėtį ir būtinas jo sintezei. atitikmenys: angl. primer rus. затравка; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймеріз — множинний іменник первинні вибори партійних кандидатів у США … Орфографічний словник української мови
Праймер произвольный — * праймер адвольны * arbitrary primer короткий олигонуклеотидный праймер, используемый в определенных ПЦР методах для инициации синтеза ДНК в случайных (произвольных) участках взятой для эксперимента ДНК мишени … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер затравка — Праймер, затравка * праймер, затраўка * primer короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК. К его 31 OH концу ДНК полимераза (см.) может добавлять нуклеотиды в растущую цепь ДНК в 51 31… … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер битумно-полимерный — ТЕХНОНИКОЛЬ № 03 (ТУ 5775 042 17925162 2006) – однокомпонентный материал холодного применения. Предназначен для обработки поверхности стальной ортотропной плиты и железобетонной плиты пролетных строений мостовых сооружений перед укладкой… … Энциклопедия терминов, определений и пояснений строительных материалов
Праймер (молекулярная биология)
Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты или связана молекула, служит исходным пунктом репликации ДНК. Праймер нужен потому, что ни одна ДНК-полимераза (фермент, который катализирует репликацию ДНК) не может начать синтез новой молекулы ДНК с одноцепочечной матрице, поскольку нужна двухцепочечная участок для присоединения к ДНК, а также они способны только присоединять нуклеотид к уже имеющейся — ОН группы на 3 ‘конце другого нуклеотида.
Репликация ДНК
В естественной репликации ДНК, в качестве праймеров используются короткие цепочки РНК длиной около 12 нуклеотидов, синтезируются ферментомпраймазою. Праймазой может присоединять как рибонулеотиды, так и дезоксирибонуклеотидов, но синтезирует именно фрагмент РНК, поскольку рибонуклеотидов в ядре больше. Эти молекулы РНК позже изымаются и заменяются на ДНК ДНК-полимеразы.
Искусственные праймеры
Многие лабораторных методов биохимии и молекулярной биологии, привлекают использования ДНК-полимеразы, например секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют праймеров. Праймеры, используемые в этих методах, обычно короткие, химически синтезированные молекулы ДНК длиной 20-30 оснований.
Для ПЦР используют 2 праймеры, которые ограничивают с двух сторон последовательность, размножается. Для повышения специфичности реакции выбирают праймеры длиной 20-30 нуклеотидов, с содержанием Г-Ц пар около 50-60%. Г-Ц пары соединены между собой тремя водородными связями, поэтому они гарантируют лучший и более выборочный связь между праймером и матрицей. Для того, чтобы последовательность праймеров была уникальная и связывалась только с одной матрицей в смеси разных молекул ДНК (например, смесь всех ДНК человека), существуют специальные программы, которые с помощью баз последовательностей ДНК подбирают нужную последовательность нуклеотидов праймера.
Для клонирования последовательностей ДНК часто в последовательности праймеров вводят дополнительные нуклеотиды — сайты рестрикции, по которым режут ферменты рестриктазы. После приумножение нужного участка ДНК в ПЦР, полученные молекулы смешивают с ферментом, который разрезает их, образуя на концах так называемые «липкие концы». Такие конце позволяют легко вставить продукт ПЦР к искусственному ДНК-вектора.
Наука
In the coming weeks, this wiki’s URL will be migrated to the primary fandom.com domain. Read more here
Праймер
Примечания
См. также
 | Это заготовка статьи по молекулярной биологии. Вы можете помочь проекту, исправив и дополнив её. |
Пререпликационный комплекс
Хеликазы ( DnaA [en] • DnaB • T7 [en] )
Пререпликационный комплекс
Комплекс распознавания Ori [en] ( ORC1 [en] • ORC2 [en] • ORC3 [en] • ORC4 [en] • ORC5 [en] • ORC6 [en] ) • Cdc6 [en] • Cdt1 [en]
Комплекс обслуживания минихромосом [en] ( MCM2 [en] • MCM3 [en] • MCM4 [en] • MCM5 [en] • MCM6 • MCM7 [en] )
Разрешающий фактор [en]
Автономно реплицирующаяся последовательность
Белки, связывающие одноцепочечную ДНК ( SSBP2 [en] • SSBP3 [en] • SSBP4 ) • РНКаза Н [en] ( RNASEH1 [en] • RNASEH2A [en] )
Хеликазы : Mcm2-7
Праймаза : ДНК-полимераза α
Точка начала репликации / Репликон
Репликационная вилка ( отстающая и лидирующая цепи) • Фрагменты Оказаки • Праймер
Холофермент ДНК-полимеразы III ( dnaC • dnaE [en] • dnaH [en] • dnaN [en] • dnaQ [en] • dnaT [en] • dnaX [en] • holA [en] • holB [en] • holC [en] • holD [en] • holE [en] ) • реплисома [en] • лигаза • Белки скользящей застёжки • Топоизомераза ( ДНК-гираза )
ДНК-полимераза I [en] ( фрагмент Кленова )
Репликационный фактор С [en] RFC1 • колеблющиеся эндонуклеазы [en] ( FEN1 [en] ) • Топоизомераза • Репликативный белок А ( RPA1 [en] )
ДНК-полимераза δ [en] ( POLD1 [en] • POLD2 [en] • POLD3 [en] • POLD4 [en] )
Белки скользящей застёжки ( PCNA [en] )
Выделить Праймер и найти в:
Комментарии читателей:
Категории: Компоненты репликационной вилки Методы молекулярной биологии
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.
Что такое полимеразная цепная реакция и как она работает?
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) составляет основу бесчисленных исследований с участием живых организмов. Из кода ДНК мы можем определить генетическую основу заболеваний, разработать лекарства, провести судебно-медицинскую экспертизу, идентифицировать микробы и многое другое.
Самое главное, что нужно для такого исследования, — это большое количество исследуемого фрагмента ДНК. Однако ДНК, выделенной из клеток, тканей или любого другого биологического источника, часто бывает недостаточно для анализа. Таким образом, ученым нужно делать больше копий ДНК.
Именно здесь и проявляется решающая роль «полимеразной цепной реакции».
Что такое полимеразная цепная реакция?
ПЦР использует способность ферментов полимеразы создавать копии генетического материала в лабораторных условиях.
До появления ПЦР копии ДНК создавались путем выделения определенного фрагмента ДНК и вставки его в геном живых клеток. Живые клетки реплицировали вставленную ДНК, одновременно реплицируя свою собственную ДНК. Этот метод был трудоемким и длительным способом получения копий ДНК, достаточных для дальнейшего изучения.
Однако теперь это уже не так. Основная заслуга в этом принадлежит Кэри Маллису, который в 1983 году изобрел «полимеразную цепную реакцию» (ПЦР), положив начало «биотехнологической революции». Сегодня ПЦР является очень распространенной лабораторной техникой даже в небольших лабораториях и используется для создания копий ДНК на регулярной основе.
ПЦР может избирательно создавать копии интересующей ДНК посредством процесса, часто называемого «молекулярным фотокопированием». После синтеза нескольких копий ДНК с помощью ПЦР ДНК подвергается «амплификации».
Каковы компоненты реакции ПЦР?
Ключевыми компонентами реакции ПЦР являются матричная ДНК, праймеры, нуклеотиды и термостойкая ДНК-полимераза. Давайте кратко узнаем о каждом из этих компонентов.
Для ПЦР можно использовать ДНК от простейших бактерий до самых сложных животных и растений. Однако вся ДНК (шаблонная ДНК) не проходит ПЦР; в ходе процесса будет амплифицирована только небольшая часть.
Нуклеотиды, используемые для реакции ПЦР, представляют собой смесь всех четырех азотистых оснований, обнаруженных в ДНК. Это аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C).
ДНК-полимераза, используемая в ПЦР, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу (часто называемую полимеразой Taq), выделенную из термофильных организмов, способных выдерживать высокие температуры.
Каковы этапы реакции ПЦР?
Активность полимеразы зависит от наличия одноцепочечной ДНК, с которой могут связываться праймеры. Этого можно добиться, нагрев образец ДНК при температуре 94-98 °C.
На следующем этапе праймеры связываются (отжигаются) с шаблонной ДНК в определенных местах. Прямой праймер связывается с началом шаблонной ДНК (одна нить двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидной последовательности ATG (стартовый кодон). Обратный праймер связывается с концом комплементарной ДНК (второй нити двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидных последовательностей TAG, TAA или TGA (стоп-кодоны). ДНК между стартовым и стоп-кодонами амплифицируется.
Успех этого этапа зависит от последовательности праймеров и температуры, выбранной для отжига, обычно 50-65 °C.
Последним и завершающим этапом является элонгация или терминация, которая происходит при 72 °C, оптимальной температуре для активности Taq-полимеразы. ДНК-полимераза распознает связанный с праймером участок ДНК и добавляет нуклеотиды, комплементарные нити шаблонной ДНК. Это происходит до тех пор, пока она не встретит второй праймер.
После успешной реакции терминации вместо одной спирали ДНК, использовавшейся на начальном этапе, образуются две спирали ДНК. В каждой из двух спиралей ДНК одна нить будет исходной нитью, полученной из образца ДНК. Другая нить будет комплементарной нитью, синтезированной ДНК-полимеразой в ходе ПЦР.
В чем заключается принцип амплификации ДНК с помощью ПЦР?
Этапы денатурации, отжига и полимеризации составляют один цикл ПЦР. Типичная реакция ПЦР может потребовать 25-35 циклов для оптимальной амплификации ДНК.
В конце одного цикла из одного шаблона ДНК образуются две молекулы ДНК. В конце двух циклов две ДНК образуют четыре молекулы ДНК, которые затем амплифицируются до восьми молекул ДНК в конце трех циклов. В конце n циклов будет 2n копий исходного шаблона ДНК.
После каждого цикла количество молекул ДНК, которые могут служить шаблонами для следующего цикла, увеличивается экспоненциально. Это увеличение числа шаблонов цикл за циклом является основой амплификации молекул ДНК в ПЦР.
Экспоненциальная амплификация молекул ДНК с помощью метода ПЦР
Каковы плюсы и минусы ПЦР?
Основные плюсы метода ПЦР заключаются в том, что он способен создавать миллионы и миллиарды копий ДНК всего за несколько часов. Этот метод быстр, относительно прост в освоении и может быть выполнен в базовых лабораторных условиях.
Основным недостатком является высокая чувствительность метода, поэтому образец, используемый для амплификации, должен быть свободен от загрязнений. Даже небольшие следы нежелательной ДНК могут амплифицироваться вместе с интересующей ДНК, что дает ложные результаты.
Другим недостатком является требование информации о последовательности ДНК для разработки праймеров. Кроме того, праймеры могут иногда отжигать не на тех участках ДНК. Такой неспецифический отжиг праймеров может привести к амплификации неправильного фрагмента ДНК.
В редких случаях ДНК-полимераза может включить неправильное основание, что приведет к изменению последовательности интересующей ДНК, что может повлиять на последующий процесс.
Для успешного проведения реакции ПЦР необходимо иметь чистый генетический материал, соответствующий набор праймеров и подходящую температуру отжига.
Где можно использовать эту технологию?
Он составляет основу большинства приложений, связанных с молекулярной биологией, клонированием генов, технологией рекомбинантной ДНК и мутагенезом.
Практическое развитие простой и универсальной техники ПЦР, предложенной Кэри Маллис, радикально изменило биологические исследования. Все, что нам нужно сделать, это смешать все компоненты ПЦР в соответствующих концентрациях в маленькой пробирке, загрузить ее в ПЦР-машину (термоциклер) и подождать несколько часов. После периода ожидания исследователи получат от миллионов до миллиарда копий интересующей вас ДНК. Разве это не удивительно?
Вот почему ПЦР всегда будет быстрым и надежным методом создания копий ДНК по сравнению с методами, использовавшимися до этого революционного открытия.