что такое репликативно компетентный вирус
Репликация компетентного вируса как важного источника смещения в моделях латентности ВИЧ с использованием однократных вирусных конструкций
Модель Т-клеток центральной памяти (ТСМ) формирует уникальную модель латентности ВИЧ-1, основанную на первичных клетках, которые очень напоминают TCM in vivo. Вирус, используемый в этой модели, основан на сконструированном векторе, неспособном к репликации после первичной инфекции. Мы показываем, что, несмотря на эту стратегию, реплицированные компетентные вирусные частицы высвобождаются в культуральную среду из-за рекомбинации между перекрывающимися последовательностями env удаленного генома ВИЧ, который совместно трансфицируется интактным env. Этот вывод подчеркивает необходимость тщательного анализа и интерпретации данных, если используются подобные конструкции, и настоятельно призывает к дополнительной осторожности во время лабораторных работ.
Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12977-014-0070-3) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.
Недавний интерес к латентности ВИЧ привел к разработке моделей клеток, которые повторяют вирусную латентность in vitro. Модель TCM, опубликованная Bosque и Planelles [1], представляет собой широко используемый метод. Эта модель, основанная на дифференцированных in vitro центральных ячейках памяти в сочетании с вирусом с дефицитом репликации, создает большое количество латентно инфицированных первичных клеток. Здесь мы показываем, что вирусная конструкция, используемая в этой модели, может стать репликацией, соответствующей рекомбинации. Мы наблюдали распространение инфекции и высокую изменчивость между повторными экспериментами с использованием этой модели TCM (дополнительный файл 1: рисунок S2). Это требует повторного анализа данных и представляет собой важную проблему биобезопасности в отношении использования подобных вирусных конструкций.
Первоначально используемую вирусную конструкцию получали с помощью вирусного вектора ВИЧ-1NL4.3-DHIV, содержащего 600 bp-делецию в рамке считывания env. Эту плазмиду совместно трансфицируют плазмидой pLET-LAI, содержащей последовательность env дикого типа из HIV-1LAI. Наши данные показывают, что вирусный супернатант состоит из смеси одиночных круглых векторов и грамотных вирусов репликации, генерируемых рекомбинацией между последовательностями env (рисунок 1, дополнительный файл 1). Рисунок 1
ПЦР и NGS-подтверждение рекомбинации между конструкциями DHIV и pLET-LAI как источник вируса, способного к репликации. Чтобы генерировать вектор, способный только к одному раунду репликации, вектор, используемый в исходной модели TCM, создается с помощью конструкции ENV с дефицитом DHIV, ко-трансфицированной интактным env. Рекомбинация между перекрывающимися последовательностями этих плазмид восстанавливает интактную последовательность env в вирусном геноме и продуцирует репликационно-компетентный вирус. (cfr. Дополнительный файл 1). А-С. Данные на основе ПЦР A. Праймерные пары, используемые в исследовании, выровнены с геном огибающей конструкции DHIV. Правая пара ENV выравнивается с общей последовательностью env DHIV и полной длины env, пара праймеров DEL выравнивается с интактной env-последовательностью в удаленной части (пунктирная линия) DHIV. ДО НАШЕЙ ЭРЫ. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР на плазмидной ДНК-NL4.3-IRES-HSA-E * и DHIV (B) и на ДНК из клеток, инфицированных указанными вирусами (C). Положительный сигнал в клетках, инфицированных DHIV + pLET-LAI, указывает на наличие полноразмерной env-последовательности в вирусной ДНК. D-F. Экспрессия РНК ВИЧ в скрытой модели TCM, полученная из анализа РНК-Seq 4 донорных клеток, инфицированных DHIV + pLET-LAI. D. Сюжет, представляющий количество раз, когда отдельные нуклеотиды были сопоставлены с геномом ВИЧ. Очерченная область указывает область env, удаленную в исходном DHIV. Большое количество отображаемых чтений указывает, что полная последовательность env выражена. E-F. Сюжет, представляющий считывания, охватывающий удаление в области env DHIV в начале (E) и конце (F) удаления. В совокупности электрофоретический анализ интегрированной провирусной ДНК и выравнивание NGS-считываний в области, первоначально содержащей делецию в env, показывают, что интактная последовательность env была восстановлена в конструкции.
Эти результаты могут быть неудивительными, учитывая строгие меры предосторожности, предпринятые в области лентивирусной трансдукции, требующие трех или четырех (до 7 а в суперраздельной системе [2]) отдельных плазмид для котрансфекции [3,4]. Однако в базовых исследованиях по ВИЧ все еще используются две векторные конструкции. В текущих выводах подчеркивается забота о биобезопасности лабораторий, работающих с векторами, которые предположительно являются репликацией, но могут стать полностью компетентными вирусами. Более того, эти данные побуждают к повторному анализу опубликованных данных, полученных из модели TCM, а также из данных с использованием аналогичных конструкций.
В оригинальной статье, описывающей модель TCM [1], NFAT характеризовался как основной фактор транскрипции, опосредующий реактивацию скрытых вирусов после стимуляции антигенами. Учитывая текущие данные, роль NFAT следует переоценить из-за его потенциального участия в двух разных явлениях: реактивации от латентности и повышении кинетики вирусной репликации, как описано ранее [5]. Нужны ли NF-κB или NFAT для реактивации скрытых вирусов в TCM. В соответствии с этим выводы о том, что путь JAK-STAT [6] или PIM-1 [7] необходимы для репликации вируса, все еще сохраняются, но данные не могут определить, является ли эффект результатом ингибирования реактивации или ингибирования репликации вируса кинетика.
В отличие от ранних интерпретаций [8], клеточное позитивное окрашивание p24 после стимуляции антигена не является однозначным признаком реактивированного вируса, а скорее комбинацией этого и распространением вирусной репликации. Поэтому количество латентно инфицированных клеток должно быть ниже, чем изначально предполагалось. Это, вероятно, повлияет на глубокие последовательности и транскриптомические эксперименты.
В недавнем исследовании сравнивались сайты интеграции между индуцированными и неиндуцированными провирусами по пяти латентным моделям, включая модель TCM [9]. Был использован вирус env (-), в котором nef был заменен GFP. После инфицирования клетки GFP (-) (предположительно, латентно инфицированные) сортировали и культивировали в течение 9 дней до анализа интеграционного сайта [9]. Несмотря на то, что стратегия сортировки исключала клетки, производящие ВИЧ, незначительная доля инфицированных клеток ранней стадии, которые еще не начали производить GFP, могла присутствовать и приводить к смещению данных. Использование антиретровирусной терапии, которая блокирует интеграцию, возможно, обеспечило количественную оценку степени этого смещения.
Интересно, что в модели TCM наблюдается явное увеличение p24 положительных клеток между образцами, обработанными ингибиторами интегразы, за которыми следует антигенная стимуляция, и образцы, которые не стимулируются. Это указывает на то, что часть инфицированных клеток скрыто инфицирована, несмотря на продолжающуюся репликацию. Таким образом, эта модель продолжает оставаться ценной для исследований по латентности ВИЧ. Это подтверждается результатами, которые были подтверждены в последующих или параллельных исследованиях с использованием альтернативных моделей.
В исследовании, характеризующем опосредованную IL-7 гомеостатическую пролиферацию [10], клетки инфицировали вирусом, кодирующим GFP, и делящиеся и не делящие GFP (-) клетки сортировали с использованием красителя для пролиферации. Оба подмножества переносили интегрированную ДНК ВИЧ и способны индуцировать вирусную продукцию после стимуляции антигена. Вывод о том, что клетки могут подвергаться гомеостатической пролиферации при отсутствии вирусного продуцирования, сохраняется, особенно учитывая стратегию сортировки. Этот механизм был поддержан данными in vivo [11]. Кроме того, данные, показывающие, что Pam3CSK4 [12] могут реактивировать ВИЧ-1, подтверждались двумя экспериментами ex vivo от ВИЧ-инфицированных авиремических пациентов. Аналогично, эффект ромадипсина на реактивацию ВИЧ, обнаруженный на экране лекарственного средства с использованием модели TCM, был подтвержден в модели ex vivo с использованием памяти пациента и покоящихся CD4 + Т-клеток [13].
Увеличение содержания p24 из-за реактивации после латентности после интеграции происходит быстро. Однако увеличение p24 из-за вирусной репликации происходит сравнительно медленнее, поскольку каждый цикл репликации требует входа, обратной транскрипции и интеграции. Следовательно, смещения в экспериментальных измерениях будут меньше при более коротких временах считывания (например, через 24 часа после реактивации), по сравнению с более длительными временами (например, через 72 часа после реактивации).
Репликационные компетентные вирусы, созданные в простых системах совместного трансфекции, могут влиять на результаты исследований в области биобезопасности и смещения. Исследователи должны предоставить доказательства, свидетельствующие о некомпетентности репликации новых конструкций. Полученные результаты влияют на ранние представления, связанные с моделью TCM, и поэтому вирус, первоначально включенный как часть этой модели, не может использоваться, как изначально описано [1]. Тем не менее, модель может по-прежнему быть пригодной для понимания латентности ВИЧ-1 при условии внесения определенных модификаций. Здесь есть два возможных варианта. Можно предпринять усилия, чтобы избежать рекомбинации путем внедрения генов огибающей, происходящих из не-ВИЧ-видов (например, VSV-G) [14], с использованием расколотых векторных систем, таких как эти, используемые в генной терапии, или более сложные системы совместной трансфекции с проверенным отсутствие рекомбинации. Альтернативно, модель может использоваться с компетентными вирусами репликации в сочетании с антиретровирусными препаратами, чтобы ограничить распространение инфекции. Наконец, мы хотели бы заявить, что мы уверены, что культивируемый TCM, сгенерированный, как описано Bosque и Planelles [1], по-прежнему является подходящей и подходящей моделью клеток для исследований ВИЧ-инфекции и латентности / реактивации, и что результаты описанные здесь, не влияют на способы получения таких клеток или их использование в лаборатории.
Дополнительный файл 1:
Экспериментальные результаты, подтверждающие рекомбинацию и исключение лабораторного загрязнения в качестве источника грамотного вируса репликации в модели Tcm, а также материалы и методы, связанные с исследованием.
На эту работу в равной степени внесли вклад Павел Бончковский и Уорд Де Шпигелере.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
PB, WDS, AB и LV разработали и спроектировали эксперименты. PB, AB, EM, MK и AVN провели эксперименты. PB, LV, WDS, AB, BV и VP проанализировали данные. CHW и CHW генерировали и анализировали данные NGS. LV, WDS, AVN, WT, JV, WW и BV предоставили техническую экспертизу на протяжении всего эксперимента. PB, WDS и LV написал рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.
Репликация вируса гепатита С: что это такое?
Гепатит С вызывают вирусы HCV (ВГС), которые являются антропонозными, то есть их жизненный цикл происходит только в организме человека. Они имеют высокий уровень гетерогенности генома, в результате чего постоянно мутируют на уровне последовательности нуклеотидов. Репликация вируса гепатита С происходит в печеночных клетках гепатоцитах, поэтому инфицированию подвергается именно этот орган.
Что такое репликация вируса?
ВГС представляет собой РНК-содержащий вирус. Он не имеет ДНК и вся генетическая информация закодирована в рибонуклеиновой кислоте. Для репликации (клонирования, размножения) вирусных агентов необходимы гепатоциты или клетки иммунитета лимфациты.
РНК содержится внутри вирусного агента и содержит более девяти тысяч нуклеотидов, из которых 30% могут подвергаться мутациям. Молекула находится в защитной капсуле, предохраняющую ее от разрушения. При проникновении внутрь клетки печени, она высвобождается и начинается процесс воспроизводства полноценного вирусного агента.
По сути, репликация — это стадия размножения вирусной частицы. Интенсивность репликативной фазы у гепатита С невелика по сравнению с другими типами инфекции. Именно поэтому заболевание сложно распознать даже в острой фазе. У большинства больных из-за вялого репликативного процесса оно сразу приобретает хроническое течение.
Стадии репликации HCV
Для выработки новых антител требуется время. Пока они появляются, вирионы снова мутируют. Считается, что они способны полностью изменять структуру каждую неделю. Таким образом, заболевание остается неизлечимым.
После проникновения патогенов в кровь многие из них погибают. Активная стадия репликации вируса начинается максимум через 2 недели после заражения, когда вирусные частицы достигают клеток печени. Эта фаза длиться до 3 месяцев и в некоторых случаях проявляется острыми симптомами, похожими на грипп. Если иммунная система сильная, то она способна победить заболевание.
Далее наступает носительство и латентная фаза, когда интенсивность размножения и активности вируса снижается. Длительность этого периода определяется состоянием иммунной системы и скоростью патологических изменений в печени.
На что влияет и от чего зависит показатель
Активность размножения патогена зависит от генотипа. Самая низкая интенсивность репликации у гепатита С 1b. Он практически сразу принимает хроническую форму и никак не проявляет себя. При этом вирусы размножаются и повреждают орган. В какой фазе находится заболевание можно узнать по маркерам гепатита С.
к.м.н. Альбина Белова
Имеются противопоказания. Перед применением проконсультируйтесь со специалистом.
Перед применением препаратов, указанных на сайте, проконсультируйтесь с врачом.
Что такое репликативно компетентный вирус
В журнале Nature опубликован очень подробный обзор, характеризующих особенности строения и жизненный цикл SARS-CoV2, механизмы инфицирования и избегания своевременного иммунного ответа, обозначены потенциальные мишени для создания противовирусных препаратов. Также представлены результаты компьютерного моделирования строения вируса и механизмов проникновения в клетку.
Особенностью данного вируса является наличие очень большого количества гликанов на поверхности спайк-протеина, маскирующих его от иммунной системы человека. Поэтому на первом этапе заболевания вирус подобен «волку в овечьей шкуре» и остается невидим для иммунной системы. В дальнейшем, когда вирус уже размножился, иммунный ответ может развиться даже избыточно, что, по-видимому, лежит в основе тяжелого течения заболевания.
В S2- субъединице спайк-протеина есть три участка, делающих «ножку» спайк-протеина гибкой, что позволяет ей «искать» рецепторы на клетках хозяина более эффективно. Такая структура довольно редка для вирусов, обычно аналогичные «шипики» на поверхности вириона ригидны (такова, например, ситуация у вируса гриппа).
Важной частью спайк-протеина является RBD-домен, функцией которого является связь с рецептором ACE2 на поверхности клетки-хозяина. У SARS-CoV2 эта связь в 2-4 раза сильнее, чем у вируса SARS. Во время взаимодействия с рецептором этот домен «выдвигается» из-за двух маскирующих его молекул гликанов. Исследования in vitro показали, что мутации в этих двух гликанах могут полностью нарушать процессы проникновения вируса в клетку. Для эффективного взаимодействия RDB и ACE2 предпочтительна более «высокая» позиция этого домена на остальными структурами. У альфа варианта вируса найдено 10 дополнительных мутаций, приводящих RBD – домен в более «высокое» положение, а у дельта вируса – еще 3 мутации.
Попав в клетку, вирус подавляет экспрессию генов клетки-хозяина, в том числе – образование интерферонов, сигнализирующих о вирусной инфекции. Для ковидной инфекции типична очень низкая концентрация интерферонов в крови.
В дальнейшем может происходить формирование синцитиев из клеток легочной ткани. Считается, что синцитии позволяют дольше и эффективнее вырабатывать вирусные белки. Такой тип агрессии типичен для персистирующих вирусов – например, ВИЧ. SARS-CoV2 индуцирует даже формирование синцитиев клеток респираторного эпителия с лимфоцитами, что мешает нормальному иммунному ответу. Такой тип «маскировки» от иммунитета типичен для опухолей, а не вирусов.
В дальнейшем перестраивается эндоплазматический ретикулум с формированием шарообразных двухмембранных структур, в которых происходит активный синтез белков вируса. Выход вирионов наружу осуществляется в лизосомах, формирующихся в комлексе Гольджи, путем экзоцитоза. Считается, что молекулярные механизмы, ответственные за описанные процессы, могут быть мишенями для противовирусной терапии.
В месте соединения S1 и S2 субъединиц спайк-протеина есть зона, которая способна связывать и быть расщепленной фурином – протеазой клетки-хозяина, содержащейся в лизосомах. Такое предварительное расщепление значительно упрощает в дальнейшем взаимодействие с трансмембранной протеазой TMPRSS2 и значительно увеличивает проникновение вирусной частицы в следующую клетку. Для вируса SARS показано, что порядка 10% вирусных частиц на выходе из клетки – хозяина связано с фурином. У вируса SARS-CoV2 в соответствующем локусе, отвечающем за связь с фурином, идентифицированы мутации. Как следствие, до 50% вирионов альфа-разновидности SARS-CoV2, выходящих из клетки-хозяина, связаны с фурином, а в случае дельта-вируса – до 90%, что, по-видимому, и объясняет более агрессивное распространение этого варианта вируса. Есть данные, что у пациентов с дельта-формой в тканях легких и носоглотки содержание вирионов достоверно выше, чем у носителей альфа-формы.
По материалам: Megan Scudellari. How the coronavirus infects cells — and why Delta is so dangerous. Nature 595, 640-644 (2021). doi:
Огромный микромир
Об этом «РГ» беседует с молекулярным вирусологом, и.о. директора Института биомедицинских систем и биотехнологий Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого, доктором биологических наук Андреем Васиным.
Андрей Владимирович, пандемия COVID-19 открыла нам глаза на то, что мир вирусов способен преподнести людям немало сюрпризов, хотя мы сталкиваемся с ними постоянно. Почему, на ваш взгляд, новый вирус оказался таким шоком для человечества?
Охвативший весь мир «свиной грипп» (т.е. вирус гриппа A/H1N1), объявленный пандемией, воспринимался просто как осложненный грипп. Плюс к этому было много разговоров про то, что это все обман с целью отвлечения внимания людей от каких-то более важных проблем, «заговор фармкомпаний, чтобы продавать больше препаратов», и т.п. А сейчас оказалось, что угроза пандемии реальна и может затронуть всех. К такому повороту событий общество многих стран, мне кажется, не было готово.
Известно, что вирусы крайне изменчивы. Чем объясняется эта их способность?
Андрей Васин: В основе всей жизни на земле лежит процесс репликации, то есть копирования генома, который у всех клеточных форм жизни представлен молекулой ДНК. За этот процесс в клетках отвечают специальные ферменты, которые называются полимеразы. В процессе репликации ДНК (у человека размер генома, например, составляет 10 в девятой степени!) неизбежно возникают ошибки. Поэтому в процессе эволюции появились специальные ферменты, которые отвечают за репарацию, то есть за устранение этих ошибок. У вирусов геном может быть представлен молекулой как ДНК, так и РНК. При этом РНК-содержащие вирусы являются более изменчивыми и патогенными, чем ДНК-содержащие. В частности, к РНК-содержащим вирусам человека относятся ВИЧ, вирус Эбола, вирус Зика, вирусы гриппа и коронавирусы, в том числе COVID-19. Изменчивость РНК-содержащих вирусов связана с тем, что у них, как правило, нет систем репарации. В результате вирусная полимераза совершает ошибки довольно часто. Размер генома вируса гораздо меньше, поэтому у них на каждый цикл репликации приходится в среднем одна мутация. С учетом скорости размножения вируса и скорости его распространения в популяции число мутаций будет довольно велико, что и объясняет такую изменчивость.
В частности, такие механизмы встречаются у коронавирусов. Реассортация и рекомбинация приводят не к плавным, а к резким изменениям биологических свойств вируса. Такая изменчивость и является одним из ключевых факторов их способности ускользнуть от иммунитета человека.
В состоянии ли наука предсказать появление более опасных штаммов тех вирусов, которые давно циркулируют среди людей?
Андрей Васин: Наука в состоянии предположить, что может сделать уже известные вирусы более опасными, изучая их молекулярно-генетические механизмы. Мы можем предполагать, на какие вирусы стоит обратить особое внимание с точки зрения их пандемического потенциала. Но сказать, какое именно событие усилит патогенность вируса в реальности и тем более когда оно произойдет, к сожалению, пока невозможно.
Известно, что существует около 250 вирусов, вызывающих ОРВИ. Однако для них не создано ни тест-систем, ни вакцин. С чем это связано? И оправдано ли такое спокойствие человечества?
Но тест-системы на определение ОРВИ есть, они широко используются в системе надзора за гриппом и другими ОРВИ, осуществляемой, в частности, Национальным центром ВОЗ на базе НИИ гриппа им. Смородинцева Минздрава России. Что касается вакцин, то ОРВИ преимущественно вызваны РНК-содержащими, то есть сильно изменчивыми вирусами, и создать эффективную вакцину от них не так просто. Мы это видим на примере вакцины от гриппа, состав которой меняется ежегодно, и прививаемся мы ею не единожды в жизни, а практически каждый год. Попытки создать вакцины и против других ОРВИ предпринимались в 1960-е годы, но они оказались безуспешными. Ярким примером является респираторно-синцитиальная инфекция, вызывающая тяжелые заболевания нижних дыхательных путей, особенно у младенцев и детей младшего возраста. Была получена инактивированная вакцина, но на стадии клинических испытаний она не только не позволила защитить от инфекции, но и существенно утяжелила заболевание. После этого работы по вакцине против РС-инфекции были надолго закрыты. Только в наше время вновь вернулись к активной разработке этих вакцин, когда открыли молекулярные механизмы усиления инфекции, возникавшего при использовании вакцины в те годы, но уже с использованием новых технологий. Сейчас на стадии доклинических и клинических исследований находится несколько десятков вакцинных препаратов. Мы также проводим доклинические исследования нашего варианта вакцины против РС-инфекции в НИИ гриппа, работа финансируется Центром стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Минздрава России.
А были ли попытки создать вакцины от коронавирусов?
Андрей Васин: Среди сезонных респираторных вирусов встречается 4 типа коронавирусов: OC43, HKU1, NL63 и 229E. И если про коронавирусы SARS (атипичной пневмонии) и MERS (ближневосточного респираторного синдрома) люди еще слышали, то про эти четыре коронавируса ничего не знают. Против них не было разработано ни лекарств, ни вакцин. Если бы они были, мы чувствовали бы себя сейчас намного уверенней и смогли бы гораздо быстрее создать вакцину или лекарственный препарат от COVID-19.
Как вы полагаете, какие изменения в нашей жизни, в организации санэпиднадзора и системы здравоохранения должны будут произойти после нынешней пандемии?
Андрей Васин: Основные изменения будут связаны скорее всего с экономическими последствиями пандемии. ВОЗ постоянно говорит о необходимости подготовки к пандемиям, разработаны соответствующие «дорожные карты». После пандемии COVID-19 эта работа будет усилена как на глобальном уровне, так и на уровне отдельных стран. А в обычной жизни, надеюсь, люди будут уделять гораздо больше внимания правилам личной гигиены, более ответственно относиться к респираторным заболеваниям и не приходить, например, на работу или в места скопления людей с ОРВИ, заражая окружающих. По крайней мере, хотя бы в первое время.
Многие годы нам рекомендовали в качестве профилактики вирусных инфекций то витамины, то модуляторы интерферонов. Теперь об этом что-то молчат. Установки изменились?
Как вы считаете, нужно ли все же выделить средства на изучение вроде бы не очень опасных респираторных вирусов, разработку тест-систем, доступную диагностику, вакцинопрофилактику и терапию?
