что такое праймер использующийся в пцр
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.
Пошаговое руководство по разработке праймеров для qPCR
Разработка праймеров для qPCR — важный шаг при постановке анализа qPCR или обратной транскрипции-qPCR (RT-qPCR). Праймеры qPCR, которые плохо отжигаются или отжигаются более чем к одной последовательности во время амплификации, могут значительно повлиять на качество и надежность результатов.
Кроме того, если вы проводите одностадийную RT-qPCR, обратная транскриптаза будет использовать обратный праймер для запуска реакции транскрипции. В этом случае некачественный праймер приведет как к неэффективной обратной транскрипции, так и к неэффективной амплификации — проигрышная ситуация.
Учитывая вышесказанное, стоит потратить время, необходимое для разработки качественных праймеров для qPCR. В этой статье мы расскажем вам, как именно это сделать!
Хорошая новость заключается в том, что праймеры дешевы, поэтому вы можете легко протестировать несколько различных пар, чтобы выбрать лучшие для вашего эксперимента.
Плохая новость: тестирование праймеров требует времени и терпения, поэтому чем быстрее вы получите пару работающих праймеров, тем лучше.
Инструмент NCBI Primer-BLAST широко используется для дизайна праймеров для qPCR. В Интернете доступно множество других инструментов для проектирования праймеров, включая primer3, а поставщики ПЦР часто предлагают свои собственные бесплатные программы для проектирования.
Ниже описаны основные этапы проектирования праймеров для qPCR с использованием инструмента NCBI Primer-BLAST.
Этапы проектирования будут аналогичными, если вы используете другие программы проектирования праймеров, и приведенная ниже информация должна дать вам представление о параметрах, на которые следует обратить внимание.
Дизайн праймеров для qPCR: Начало работы
Зайдите в базу данных генов Pubmed и выполните поиск интересующего вас гена. В правом углу следующего экрана вы можете отфильтровать по видам.
Нажмите на интересующий вас ген и прокрутите страницу вниз, пока не найдете NCBI Reference Sequence (RefSeq) для вашего гена (например, «NM_203483»).
Нажмите здесь, и на следующем экране в правом углу экрана вы увидите ссылку «Pick primers».
Параметры праймеров для qPCR
Установите следующие параметры праймеров:
Размер продукта ПЦР/ампликона: Для эффективной амплификации подберите праймеры таким образом, чтобы длина ампликона составляла от 70 до 200 п.н.
Количество праймеров для возврата: Это зависит от вас, в зависимости от того, сколько вариантов вы хотите выбрать. Программе не потребуется много времени, чтобы разработать 10 пар праймеров, и это должно дать вам разумный шанс найти подходящую пару.
Температура плавления: Как правило, следует стремиться к минимальной температуре 60°C и максимальной 63°C; идеальная температура плавления составляет 60°C (с максимальной разницей в 3°C в температурах плавления, Tm, двух праймеров). Для определения этих температур можно использовать калькулятор Tm.
Выбор экзона/интрона
Чтобы избежать амплификации загрязняющей геномной ДНК, подберите праймеры таким образом, чтобы одна половина праймера гибридизовалась с 3′-концом одного экзона, а другая половина — с 5′-концом соседнего экзона.
Для этого просто выберите «Праймер должен охватывать стык экзона и экзона». Другие параметры изменять не нужно.
Параметры проверки специфичности пары праймеров: Используйте настройки по умолчанию. Программа будет использовать последовательность RefSeq мРНК выбранного вами организма для конструирования праймеров.
Проверка экрана вывода
Посмотрите на параметры, которые выдала программа, и обратите особое внимание на следующее:
Убедитесь, что 3′-конец праймера содержит остаток C или G, поскольку остатки T и A легче связываются с ДНК неспецифическим образом.
Стремитесь к содержанию GC около 40-60% для обеспечения максимальной стабильности продукта.
Избегайте самокомплементарности, чтобы снизить вероятность образования праймер-димеров. В идеале праймер должен иметь почти случайный набор нуклеотидов.
Теперь выберите два-три лучших праймера и протестируйте их. Удачи!
Если у вас есть другие лучшие советы по разработке праймеров для qPCR, мы будем рады услышать вас в комментариях!
СОДЕРЖАНИЕ
Механизм образования
Димер праймера образуется и амплифицируется в три этапа. На первом этапе два праймера отжигаются на их соответствующих 3′-концах (этап I на рисунке). Если эта конструкция достаточно стабильна, ДНК-полимераза будет связывать и удлинять праймеры в соответствии с комплементарной последовательностью (этап II на рисунке). Важным фактором, способствующим стабильности конструкции на этапе I, является высокое содержание GC на 3′-концах и длина перекрытия. Третий этап происходит в следующем цикле, когда одна нить продукта этапа II используется в качестве матрицы, к которой отжигаются свежие праймеры, что приводит к синтезу большего количества продукта PD.
Обнаружение
Димеры праймеров могут быть видны после гель-электрофореза продукта ПЦР. PD в гелях, окрашенных бромидом этидия, обычно видны как полоса из 30-50 пар оснований (п.о.) или мазок от умеренной до высокой интенсивности и отличимые от полосы последовательности-мишени, которая обычно длиннее 50 п.о.
Предотвращение образования димера праймера
Программа для праймеров
ПЦР с горячим стартом
Воск : в этом методе фермент пространственно отделяется от реакционной смеси с помощью воска, который плавится, когда реакция достигает высокой температуры.
Медленное высвобождение магния : ДНК-полимеразе для активности требуются ионы магния, поэтому магний химически отделяется от реакции путем связывания с химическим соединением и выделяется в раствор только при высокой температуре.
Чувствительная к холоду полимераза Taq : это модифицированная ДНК-полимераза, практически не проявляющая активности при низкой температуре.
Структурные модификации праймеров
Другой подход к предотвращению или уменьшению образования частичных разрядов заключается в модификации праймеров таким образом, чтобы отжиг между собой или друг с другом не приводил к удлинению.
Блокированные-расщепляемые праймеры : метод, известный как РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR), использует термостабильную РНКазу HII для удаления блокирующей группы из праймеров ПЦР при высокой температуре. Этот фермент РНКаза HII почти не проявляет активности при низкой температуре, поэтому удаление блока происходит только при высокой температуре. Фермент также обладает свойством распознавания несоответствия праймер: матрица, что приводит к дополнительной селекции против димеров праймеров.
Предотвращение получения сигнала от димеров праймеров
Четырехэтапная ПЦР : используется при работе с неспецифическими красителями, такими как SYBR Green I. Она основана на разной длине и, следовательно, разной температуре плавления PD и целевой последовательности. В этом методе сигнал получается ниже температуры плавления целевой последовательности, но выше температуры плавления PD.
Зонды, специфичные для последовательности : зонды TaqMan и молекулярные маяки генерируют сигнал только в присутствии своей целевой (комплементарной) последовательности, и эта повышенная специфичность препятствует получению сигнала (но не возможному ингибирующему воздействию на накопление продукта) от PD.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.
Суть метода ПЦР
ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.
Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.
Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.
Преимущества метода ПЦР
Какие есть недостатки
Показания к проведению ПЦР-анализа
Подготовка к проведению ПЦР-теста
Как проводится ПЦР-анализ
Результаты ПЦР-теста
Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.
Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!