что такое биопленка в микробиологии
Клиническое значение микробных биопленок
Существуют ли какие-то способы воздействия на процесс формирования биопленок, или способы разрушения уже существующих биопленок? Естественно, за короткий срок лекции мы не сможем охватить сотни тысяч публикаций, но я покажу вам несколько коротеньких выдержек из них. Начиная с конца 1990-х годов в литературе стали появляться работы, изучающие возможность некоторых препаратов, например, кларитромицина, ингибировать образование гликокаликса, который продуцируется в данном случае метициллинрезистентным золотистым стафилококком [2]. Авторы другой работы приводили данные сравнительных исследований, доказывающие способность кларитромицина в комбинации с цефалоспорином I поколения или ванкомицином препятствовать образованию биопленок на титановом медицинском оборудовании [3]. Для синегнойной палочки также выявлена способность к формированию биопленки. При детальном изучении механизма воздействия препарата кларитромицин на образование биопленки, было показано, что структура биопленки изменяется, уменьшается количество альгината, гексозы, истончается гликокаликс, тем самым повышается проникновение антимикробного препарата, который использовали для подавления синегнойной палочки, в данном случае – фторхинолон. Эффективность фторхинолона оказалась значительно выше в присутствии кларитромицина, что привело к эрадикации синегнойной палочки [4]. Интересны также клинические исследования на больных с муковисцидозом и диффузным панбронхиолитом, в ходе которых было показано совместное использование для воздействия на синегнойную палочку кларитромицина с этиотропными антибиотиками [5].
На рисунке представлен микропрепарат, полученный нами при специальной окраске биопленки, образованной эпидермальным стафилококком, штамм выделен из клапана больного с инфекционным эндокардитом. Как видно на рисунке (увеличенный фрагмент) биопленка представляет собой не только микроорганизмы, стафилококки, но и поры, каналы, которые пронизывают эту биопленку, эти каналы обеспечивают как распространение питательных веществ внутрь биопленки для питания бактерий, так и выделение продуктов метаболизма в окружающую среду, напоминая, таким образом систему кровеносных сосудов [6].
Рисунок 1. Биопленка S.epidermidis с клапана сердца при инфекционном эндокардите
Проблема инфекции, вызванной синегнойной палочкой, чрезвычайно актуальна, и, по-видимому, она так долго оставалась нерешенной именно потому, что вопросы воздействия на биопленку ранее не были известны. Нами было проведено исследование, доказывающее способность препарата клацид (кларитромицин) препятствовать образованию биопленки. Это исследование мы провели ин-витро. Синегнойная палочка выращивалась как планктонная форма, в пробирке, и, как биопленка – на пластиковой чашке Петри. Соответственно, через 2, 4, 6 или 8 часов от момента посева микроорганизма в питательную среду, мы добавляли антибактериальные препараты. В контрольной чашке, где была засеяна синегнойная палочка, и сразу был добавлен карбапенем (имипенем), биопленка не образовалась. Действительно, чувствительность штамма к имипенему была установлена заранее, и препарат сработал так, как и ожидалось. Но если мы добавляли имипенем позднее, то есть дали возможность микроорганизму просуществовать в питательной среде какое-то время, то мы обнаружили, что биопленка все равно потом образовалась, то есть добавление имипенема не смогло препятствовать образованию биопленки, образованной синегнойной палочкой. То есть даже карбапенем, активный в отношении синегнойной палочки (имипенем), не сумел препятствовать формированию биопленки. Мы попробовали провести тот же эксперимент с одним кларитромицином в форме монотерапии. После добавления кларитромицина, чашка не была прозрачной, то есть микроорганизмы в этой чашке продолжали размножаться. Но вот когда мы добавили одновременно этиотропный препарат имипенем (карбапенем) и кларитромицин, в результате получили абсолютно прозрачную чашку, то есть биопленка в этой ситуации не образуется. Каждый из этих экспериментов был повторен многократно, для того, чтобы убедиться в действительно объективной картине. В таблице 1 обобщены полученные нами данные. В контроле, независимо от времени добавления антибиотиков, во всех случаях, естественно, был рост и в планктонной форме, и в виде биопленки. Но одновременное использование имипенема вместе с клацидом, препятствовало формированию биопленки.
Таблица 1. Результаты, полученные при исследовании влияния кларитромицина и имипенема, а также их комбинации на формирование биопленок
Таким образом, наши экспериментальные данные полностью подтвердили зарубежные. Даже «мощный» карбапенем, эффективен только в пределах 4 часов после развития синегнойной инфекции, вызванной планктонными формами и неэффективен если образуется биопленка. Кларитромицин разрушает биопленку P. аeruginosa независимо от времени введения, существенно повышая активность антисинегнойного антибиотика. Несмотря на то, что кларитромицин не смог препятствовать росту синегнойной палочки, поскольку синегнойная палочка не входит в его антимикробный спектр, одновременное использование кларитромицина и карбапенема препятствовало размножению синегнойной палочки и образованию биопленки в нашем эксперименте. Таким образом, для повышения эффективности лечения нужно проводить «анти-биопленочную» терапию: этиотропные препараты комбинировать с кларитромицином.
Еще один очень важный аспект – то, что микробные биопленки во много раз снижают эффективность антибиотиков, то есть повышают устойчивость бактерий к антибиотикам по некоторым данным, в 100-1000 раз [7]. В то же время, исследования целого ряда авторов показали, что кларитромицин не только разрушает матрикс биопленок, образованных P. аeruginosa, но и снижает ее двигательную активность, что приводит к снижению вирулентности и существенному повышению эффективности специфических антисинегнойных препаратов [8]. Кроме того, кларитромицин разрушает матрикс биопленки, облегчая доступ другим антибиотикам [9].
Таблица 2. Сравнительная эффективность кларитромицина и плацебо в комбинации с этиотропными антибактериальными препаратами у пациентов с ИВЛ-ассоциированной пневмонией и нозокомиальным сепсисом по [10]
Какое резюме хотелось бы сделать после изложенных выше данных? Разумеется, у тяжелых больных, у больных в отделениях интенсивной терапии, у больных с хроническими заболеваниями, до сих пор роль микробных биопленок, недооценивается, и на сегодняшний день имеются достаточно обнадеживающие данные о том, что комбинированная терапия этиотропным антибиотиком, вместе с кларитромицином, действительно целесообразна. Благодарю вас за внимание.
Список литературы:
1. Olson ME et al. Biofilm bacteria: formation and compararive susceptibility of antibiotics. Can J Vet Res 2002 April; 66(2): 86-92.
2. Sano M, Hirose T, Nishimura M et al. Inhibitory action of clarithromycin on glycocalyx produced by MRSA. J Infect Chemother 1998; 5:10-5.
3. Fujimura S, Sato T, Mikami T et al. Combined efficacy of clarithromycin plus cefazolin or vancomycin against Staphylococcus aureus biofilms formed on titanium medical devices. Inter J Antimicrob Agent 2008; 32(6):481-4.
4. Yasuda H, Ajiki Y, Koga T et al. Interaction between biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and clarithromycin. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37(9): 1749-1755.
5. Wozniak DJ, Keyser R. Effects of Subinhibitory Concentrations of Macrolide Antibiotics on Pseudomonas aeruginosa. Chest 2004; 125:625-695.
6. Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, et al. Microbial Biofilms. Ann Rev Microbiol 1995; 49:711-45.
7. Ryder MA. Catheter-Related Infections: It’s All About Biofilm. Topics in Advanced Practice Nursing eJournal. 2005;5(3); Olson ME et al. Biofilm bacteria: formation and compararive susceptibility of antibiotics. Can J Vet Res 2002 April; 66(2):86-92.
8. Wozniak DJ, Keyser R. Effects of Subinhibitory Concentrations of Macrolide Antibiotics on Pseudomonas aeruginosa. Chest 2004; 125:625-95.
9. Sano M, Hirose T, Nishimura M et al. Inhibitory action of clarithromycin on glycocalyx produced by MRSA. J Infect Chemother 1998; 5:10-15.
10. Giamarellos-Bourboulis EJ, Baziaka F, Antonopoulou A et al. Intravenous Clarithromycin in Septic Syndrome. Int J Antimicrob Agent 2008; 32S:39-43.
Микробная биоплёнка. Основные понятия
Биоплёнки как форма существования микроорганизмов и их сообществ
Как бактерии образуют биоплёнку
Сегодня под термином биоплёнка понимают особую форму существования микроорганизмов и их сообществ, образующуюся на границе раздела фаз (обычно твёрдой и жидкой) и характеризующуюся набором свойств, отличных от совокупности автономных клеток микроорганизмов в чистой культуре. К образованию биоплёнок способно подавляющее большинство микроорганизмов.
Биопленка как основа иммунной защиты
Перед тем, как рассмотреть вопрос формирования и состава микробной биопленки, отметим ее важность для иммунной защиты человеческого организма. Как было отмечено выше, 95-99% всех микроорганизмов в естественной среде существует в виде биоплёнки. Это касается и нашего кишечника, в котором, в свою очередь, сосредоточено около 70% всех иммунных клеток организма человека. Так как основной функцией иммунной системы кишечника является защита от проникновения бактерий в кровь, а также устранение патогенов, то состояния биопленки, которая является микробиологической составляющая эпителиального барьера кишечника, во многом зависит эффективность иммунитета.
Именно правильный состав и метаболическая активность собственной микрофлоры, активные эпителиальные клетки слизистой с рабочими сайтами адгезии, качественное питание (содержащее пищевые волокна, витамины и минералы), а также моторно-эвакуаторное функционирование ЖКТ – все это является основой защиты кишечника от его заселения патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
Микробная биопленка – это сложный комплекс, образованный многовидовыми микробными ассоциациями и поверхностными структурами организма, к которым они адгезировались. Биопленка может быть «плохой» (патогенной) и «хорошей» (из защитной микрофлоры). От состава и активности микрофлоры биопленок зависят гомеостаз и гемостаз любого живого организма. Симбиотические ассоциации, составляющие нормальную микрофлору человека и животных, сформировались в результате взаимодействия макро- и микроорганизмов, эволюционирующих параллельно и взаимосвязано. При этом произошел отбор видов микробов, способных к прикреплению (адгезии) и колонизации слизистых и кожных покровов и использующих организм хозяина в качестве среды обитания. Без прямого или косвенного участия микрофлоры не обходится ни один процесс, ни одна функция в организме. Без микрофлоры нет иммунитета (а без дисбиоза нет инфекционного процесса). Микробиом контролирует не только иммунитет и пищеварение, но и гормональную систему, и условно-рефлекторную деятельность.
Как бактерии образуют биопленку:
Представленная анимация и покадровые иллюстрации показывают, как бактерии образуют биопленку. Биопленка, более известная как «слизь», представляет собой поверхностно-прикрепленное сообщество микроорганизмов. Формирование биопленки включает в себя ряд бактериальных процессов, включая бактериальную сигнализацию и зондирование кворума, производство пили и секрецию внеклеточной полимерной матрицы. Эта анимация была произведена для центра микробных инноваций, в университете Окленда, Новая Зеландия.
О биопленке более подробно:
Составные компоненты биоплёнки
Биоплёнки представляют собой сложные многокомпонентные трёхмерные структуры. В большинстве случаев в составе любой биоплёнки можно выделить как минимум два исходных компонента – клеточная биомасса и матрикс. В составе биоплёнок клетки микроорганизмов, прикреплённые к поверхности субстрата, равномерно покрываются матриксом – сложным комплексом биополимеров (рис.1).
По своему клеточному составу можно выделить два основных типа биопллёнок:
Моновидовые биоплёнки содержат в своём составе только один вид микроорганизмов. В природных условиях такие биоплёнки встречаются достаточно редко. В основном они формируются некоторыми патогенными микроорганизмами в тех органах и тканях макроорганизма, которые в норме являются стерильными. Примером таких биоплёнок и вызываемых ими поражений может служить образование биоплёнки P.aeruginosa в лёгких людей больных муковисцидозом.
Поливидовые биопленки. Большинство биоплёнок, образующихся в окружающей среде, относится к поливидовым биоплёнкам. Такие биоплёнки представляют сложные сообщества, состоящие из многих видов микроорганизмов. В пределах такого сообщества можно обнаружить клетки бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, простейших, а так же частицы вирусов, в основном бактериофагов.
МАТРИКС
Важнейшим компонентом биоплёнки является матрикс (внеклеточная полимерная субстанция). Он представляет собой комплекс биополимеров, синтезируемый клетками микроорганизмов, входящих в состав биоплёнки. В состав матрикса входят полисахариды, структурные белки, экзоферменты, нуклеиновые кислоты (рис.2.-слева).
Матрикс играет огромную роль в организации и функционировании биоплёнок. Прежде всего, он способствует пространственной организации этих структур, отграничивая биоплёнки от негативного влияния внешней среды. Значительная степень вязкости матрикса, за счёт полисахаридов позволяет с одной стороны сконцентрировать синтезируемые экзоферменты рядом с клетками, тем самым, повышая их концентрацию в определённой точки пространства, а, с другой стороны, препятствует равномерному распределению по всей биоплёнке неблагоприятных для неё веществ, таких как, например, антибиотики и дезинфектанты. Компоненты матрикса биоплёнки так же могут служить резервными источниками основных биогенных элементов в случае прекращения поступления питательных веществ, что позволяет клеткам, входящим в состав биоплёнки некоторое время существовать в условиях сокращающегося притока питательных веществ.
Среди основных функций матрикса можно выделить следующие:
Полисахариды матрикса биоплёнки
Среди всех компонентов входящих состав матрикса биоплёнки основную роль в его построении играют экзополисахариды (ЭПС). В количественном соотношении это наиболее распространённые в матриксе биополимеры. В среднем, в зависимости от конкретной биоплёнки их количество варьирует от 50 до 90 % от общей сухой массы веществ матрикса.
Большинство экзополисахаридов биоплёнки представляют собой достаточно длинные полимеры с молекулярной массой от 0,5 х 10 6 до 2 х 10 6 дальтон. На сегоднешний день полисахариды найдены в матриксах биоплёнок практически всех микроорганизмов. Применение различных биохимических методов, а так же методов электронной и флуорисцентной микроскопии (с использованием меченных флуорисцентными красителями лектинов и моноклональных антител) позволило детально охарактеризовать многие из этих биополимеров. Основная роль полисахаридов в составе матрикса биоплёнки – придание жесткости конструкции за счёт взаимодействия между отдельными полимерами. Это обусловлено тем, что между цепями ЭПС осуществляются слабые физико-химические взаимодействия, стабилизирующие структуру (рис.3).
Рис.3. Слабые физико-химические взаимодействия между цепями ЭПС матрикса биоплёнки
Среди таких взаимодействий можно выделить следующие:
По своему составу полисахариды матрикса биоплёнки можно разделить на два основных типа – гомополисахариды и гетерополисахариды. Гомополисахариды в составе матрикса биоплёнки встречаются лишь у относительно небольшого числа микроорганизмов. Они обычно представляют собой производные сахарозы, например, глюканы и фруктаны синтезируемые бактериями рода Streptococcus в биплёнках на поверхности зубов, и целлюлоза, синтезируемая Gluconobacter xylinus, Agrobacterium tumifaciens, Rhizobium spp. а так же некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae.
Экзополисахариды матрикса биоплёнки большинства бактерий относятся к гетерополисахаридам, которые представляют собой смесь из нейтральных и заряженных остатков сахаров. Так же они содержат значительное количество различных органических и неорганических заместителей, которые в значительной степени влияют на их физические и биологические свойства. Так, в связи с наличием в составе уроновых кислот (а так же иногда пирувата и сульфатов) некоторые такие полисахариды, включая альгинат, ксантан и колановую кислоту являются полианионными. Так же существуют и поликатионные адгезины.
Белки матрикса биоплёнки.
В биоплёнках обнаруживается значительное количество различных экзоферментов, многие из которых вовлекаются в деградацию биополимеров. Субстратом для этих ферментов являются водорасстворимые компоненты (такие как полисахариды, нуклеиновые кислоты и белки), а так же некоторые водонерасстворимые полимеры (целлюлоза, хитин, липиды) и различные органические частицы захваченные биоплёнками. Основные ферменты матрикса биоплёнки приведены в таблице 1.
Таблица 1. Основные ферменты матрикса биоплёнки
Что такое биопленка в микробиологии
1) Новосибирский государственный медицинский университет, Новосибирск, Россия; 2) Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, Москва, Россия
Введение
С момента открытия микробов Антони ван Левенгуком, т.е. почти 350 лет назад, основным объектом их изучения были и в значительной степени остаются изолированные клетки микроорганизмов. Активно изучаются их морфологические, биохимические, генетические свойства, кроме того, в отношении изолированных микроорганизмов определяется чувствительность к различным антимикробным препаратам. Именно эти научные данные составляют базу современных микробиологии и фармакологии. Все умозаключения и прогнозы по течению патологического инфекционного процесса и направления этиотропной антимикробной терапии базируются на представлениях, будто основной причиной инфекционного процесса и заболевания служит множество одинаковых и самостоятельных микроорганизмов.
Однако уже более 30 лет назад была сформулирована концепция микробных сообществ, получивших название «биопленки» (англ. – biofilms), которая является одним из наиболее важных достижений микробиологии и в целом медицины последних лет [1]. Жизнь микробов в составе сообществ биопленок столь же принципиально отличается от этих давно сформировавшихся представлений, как жизнь охотника-одиночки, от существования огромного мегаполиса [2, 3]. Сегодня уже достоверно установлено, что и в естественных условиях, и в организме человека и животных, и в условиях производств все микробы не существуют как самостоятельные и изолированные клетки, а находятся в составе биопленок [4, 5]. В организме человека микробные сообщества образуют все представители нормальной микрофлоры и возбудители болезней. Формирование и распространение биопленок в организме играют важнейшую роль в развитии патологического процесса [6, 7].
В последние годы на основании данных Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) доказано, что более 70% инфекционных заболеваний человека сопровождаются образованием биопленок [8]. К ним относят основные инфекционные болезни всех систем и органов, включая и т.н. терапевтические инфекции (например, Helicobacter pylori). При том что инфекционные заболевания остаются ведущей причиной смертей во всем мире, очевидно, что именно применение антибиотиков служат основой этиотропной терапии большинства болезней. Появление в арсенале лекарственной терапии антибиотиков позволило за последние 70 лет резко снизить смертность и значительно повысило продолжительность жизни людей. Однако рост антиботикорезистентности (АБР) в последние годы привлек внимание исследователей к феномену биопленок как одной из ведущих причин АБР [7–11].
Большой и постоянно растущий интерес исследователей к этой проблеме подчеркивается и количеством публикаций на тему биопленок; например, ресурс PubMed отражает наличие более 38 тыс. публикаций на эту тему, статистика по годам приведена на рис. 1.
Биопленки
Явление образования биопленок открыто в середине 1980-х гг. [12–13]. Первоначально биопленки микроорганизмов рассматривались как механизм, позволяющий выживать бактериям в сложных условиях. Но дальнейшее изучение позволило понять, что биопленки служат естественной формой существования микробов, в то время как планктонные (свободноживущие) формы представляют лишь одну из стадий развития микробного сообщества [6, 14–15].
В течение последующих лет исследований биопленок было доказано, что биопленкообразование присуще массе патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [16–17], а механизм образования биопленок расценивается как фактор патогенности [6, 7, 16].
Строение биопленок
Микробные биопленки – это сообщества, образованные родственными и неродственными бактериями, отграниченными от внешней среды, внутри которых клетки имеют специализацию и контактируют между собой.
Ключевыми особенностями биопленок считают:
Все представители нормальной микрофлоры в организме человека существуют в составе биопленок. Биопленки представляют собой сообщества микробов, поддерживающих свой состав и расселяющихся за счет клеток, которые периодически высвобождаются и мигрируют, способствуя распространению инфекции. Биопленки разных микробов имеют сходный принцип строения. Все они содержат бактерии и межклеточный матрикс, в котором выделяют поверхностную оболочку, отграничивающую сообщество от окружающей среды [8, 11, 18–19]. В состав поверхностной оболочки и матрикса биопленок входят полисахариды в количестве от 40 до 95% (в т.ч. декстран, гиалуроновая кислота, целлюлоза и др.). Концентрация прочих химических компонентов сильно варьируется. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот (внеклеточной ДНК и РНК) 1–20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, т.к. 80–90% объема биопленки занимает вода [8, 13]. Известно, что внеклеточная ДНК и белки бактериальных биопленок играют важную роль в морфогенезе и функциональных изменениях биопленок, необходимых для их сохранения [20–21]. Поверхностная мембрана состоит из компонентов клеточных мембран участников сообщества и обладает схожими свойствами (рис. 2).
Существование бактерий внутри изолированных биопленок обеспечивает им много преимуществ по сравнению с изолированными клетками. Для практической медицины особенно важно, что бактерии в биопленках характеризуются повышенной выживаемостью в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты и антибиотиков. Бактерии в биопленках выживают в присутствии антибиотиков, добавленных в количестве, в 500-1000 раз большем, чем их минимальная подавляющая концентрация [10, 16]. В настоящее время идет интенсивное изучение причин такой удивительной устойчивости к антибиотикам у бактерий биопленок. Установлено, что в основе повышенной выживаемости лежат свойства клеток и внеклеточного матрикса (табл. 1).
Фазы развития и строение биопленок
Формирование биопленки проходит несколько значимых этапов: адгезия, размножение, созревание, выход планктонных форм (рис. 3).
Рис. 4 представляет многообразие внутренней среды колоний: помимо собственно клеток с признаками дифференциации матрикс содержит белки и полисахариды, жирные кислоты и другие продукты жизнедеятельности; фрагменты ДНК, а также массу низкомолекулярных веществ, имеющих регуляторную функцию т.н. сигнальных молекул.
Матрикс, внеклеточная полимерная субстанция (extracellular polymeric substances), внутренняя среда сообществ биопленок, имеет огромное значение в жизни микробного сообщества: он формирует внутреннюю среду, может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики; обеспечивает циркуляцию питательных веществ и жидкостей, транспорт токсинов, метаболитов, газов, сигнальных молекул и т.п. [20–23].
Компоненты биопленки как факторы АБР
Для обособленных (небиопленочных или планктонных) микробных клеток классическими признаны пять типов устойчивости к антибиотикам: модификация мишени, инактивация антибиотика, активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс), нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки, формирование метаболического шунта [24]. Накопленная научная информация позволяет утверждать, что у микробов в биопленках присутствуют почти все типы «планктонной» резистентности (табл. 2).
Эффективность проникновения антибиотиков в значительной степени связана с их способностью преодолевать поверхностную оболочку и межклеточный матрикс биопленок.
В составе последних содержится значительное количество различных липидов, по качественному составу аналогичных мембранным [25, 26].
Установлено, например, что в биопленки Klebsiella pneumoniae плохо проникает ампициллин, а в сообщества Enterococcus faecalis – ампициллин, ко-тримаксозол и ванкомицин [27, 28]. В биопленки ряда микробов по тем же механизмам затруднено проникновение амоксициллина [29].
Однако в биопленках существуют еще и особые, присущие только им формы устойчивости, которые могут быть связаны по крайней мере с тремя или даже более типами механизмов [34, 35]. Первым из них следует считать формирование клеток-персистеров. Персистеры – это фенотипический вариант клеток с обычным для данного штамма генотипом, но с сильно заторможенным метаболизмом. Состояние метаболической инертности клеток с выключением многих биохимических процессов образно называют бактериальным анабиозом [36]. Именно поэтому персистеры устойчивы практически ко всем препаратам [36–38].
По разным данным и в разных популяциях доля персистеров сильно различается, составляя от 15 до 85%, при этом отмечается, что в неблагоприятных условиях она значимо возрастает [38–40].
Внутри как мономикробных, так и неродственных (полимикробных) сообществ резистентность может быть связана с фильтрующей способностью матрикса. Наблюдения in vitro показали, что матрикс бактериальных биопленок состоит из различных биополимеров – полисахаридов, белков и даже ДНК [41]. Матрикс образовывает внутреннюю среду сообщества, пространственно и функционально связывая клетки в единую структуру, заполняет все межклеточные пространства, образуя трехмерную сложнейшую систему, созревающую вместе с сообществом. Все это позволяет считать поверхностную мембрану и матрикс своеобразным «молекулярным фильтром» и выделять фильтрацию поступающих веществ в качестве одной из важнейших функций биопленки [20, 42]. Опубликованы работы, в которых наблюдали замедленную диффузию антибиотиков внутрь биопленок. Например, было описано затруднение пенетрации ципрофлоксацина внутрь биопленки, сформированной P. aeruginosa [43]. Показано, что поверхностно (по отношению к мембране биопленки) расположенные бактерии подвержены воздействию антибиотика сильнее, чем глубоко расположенные клетки [44]. Механизмом этих эффектов может быть как связывание антибактериальных агентов, так и их инактивация.
Предложена 3-уровневая систематизация устойчивости бактерий к антибиотикам, учитывающая наличие биопленок [45]. Связанный с биопленками надклеточный уровень устойчивости называют толерантностью, она определяется трудностями преодоления антибиотиками поверхностной оболочки биопленки и матрикса, а также неэффективностью действия на часть клеток (персистеры), находящихся в не доступном для антибиотиков состоянии [46]. Второй уровень устойчивости определяется свойствами клеточной стенки, мембраны бактерий и наличием выкачивающих помп, обеспечивающих резистентность к противомикробным препаратам. Третий уровень – цитоплазматический, ассоциированный с изменением свойств мишени и регуляцией генов. Также отмечается, что спорообразующие бактерии имеют дополнительный четвертый уровень, связанный с устойчивостью бактериальных спор к действию антибиотиков и антисептиков/дезинфектантов [35, 47].
Кворум-сенсинг
Еще одной ключевой особенностью биопленок является феномен Quorum sensing (QS), дословно – чувство кворума. QS – это процесс коллективной регуляции посредством координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Впервые явление межклеточной коммуникации обнаружено и описано у симбиотической морской бактерии Vibrio fischeri [48]. Формирование, рост, дифференциация планктонных и биопленочных фенотипов клеток в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации, формируясь при достижении некоей критической массы/количества бактерий-участниц [49]. Установлено, что клеточно-клеточные взаимосвязи влияют и на экспрессию генов вирулентности, регулируют ростовые процессы, характер и направление подвижности (таксис), а также бактериальный апоптоз и токсинообразование [34, 35, 49].
Функция QS аналогична гормональной регуляции различных органов и тканей в многоклеточном организме. Разные микробы используют различные сигнальные системы и разные химические передатчики сигналов: 7–8-членные пептиды и циклопептиды характерны для грамположительных, а разнообразные ацилгомосерин лактоны (AHL) – для грамотрицательных микроорганизмов [8]. QS на основе AHL обнаружен у многих грамотрицательных бактерий: Aeromonas, Acinetobacter, Brucella, Burkholderia, Chromobacterium, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia и др. [50]. Именно за счет реакций QS осуществляются «социальные» отношения внутри популяции, образуется «коммуникационная сеть», при этом такое «общение» возможно и среди неродственных микроорганизмов.
К интересным и важным следует отнести и обнаруженный феномен «читинга» (от англ. cheating – обман, мошенничество), который заключается в следующем: даже дефектные по способности синтезировать биопленочный матрикс и формировать самостоятельные биопленки микроорганизмы могут участвовать в биопленкообразовании, используя компоненты биопленок, продуцируемые другими микробами [20, 51]. В данном контексте само понятие «небиопленкообразующие микроорганизмы» теряет свой смысл.
Роль микробных биопленок в развитии гинекологической патологии
Нормальный биотоп влагалища также представлен в виде биопленок, выстилающих поверхность слизистой оболочки. При нарушении вагинального микробиоценоза происходит элиминация лактобацилл, сопровождающаяся колонизацией влагалища анаэробами: Fusobacterium, Mobiluncus, Peptostreptococcus, Gardnerella vaginalis. Именно последней, G. vaginalis, факультативно-анаэробной грамотрицательной палочке, отдается ключевая роль в развитии бактериального вагиноза (БВ) [52]. Он чаще всего характеризуется полимикробной этиологией, однако основным запускающим процесс патогеном является именно G. vaginalis. Биопленка G. vaginalis притягивает к себе другие микроорганизмы, образуя конгломерат бактерий, в большинстве своем обладающих патогенным для макроорганизма эффектом. Биопленки, как было установлено, состоят в основном из G. vaginalis, в то время как Atopobium vaginae присутствует в 80% случаев и составляет 40% от массы биопленки. Другие бактерии встречаются намного реже, в т.ч. бактерии, принадлежащие к родам Bacteroides, Corynebacterium, Lactobacillus, Veillonella, Ruminococcus и Streptococcus [52–54].
Вагинальные биопсии у женщин без нарушений вагинального микробиоценоза показали в основном свободно распределенные молочнокислые бактерии, в т.ч. Lactobacillus, Streptococcus, и Enterococcus.
Основные постулаты концепции биопленок:
Далее было обнаружено, что G. vaginalis представлена в двух различных состояниях, т.е. слущенные клетки существуют либо как диспергированные Gardnerella в виде свободно циркулирующих клеток, указывающих на планктонный рост, либо как сцепленные со слизистой оболочкой бактерии, состоящие из кластеров клеток с адгезией на эпителии, что свидетельствует о присутствии Gardnerella в виде биопленки [53]. Доказано, что G. vaginalis обладает наибольшей способностью к адгезии и цитотоксичностью в отношении клеток вагинального эпителия. При этом G. vaginalis формирует биопленку, значительно более массивную, чем другие БВ-ассоциированные анаэробы [54]. Перенос биопленки и заражение БВ, как правило, происходят половым путем [55, 56].
По образному сравнению A. Swidsinski: «Биопленка при бактериальном вагинозе –это густой лес, где высокие, могучие деревья – гарднереллы. Они создают условия для жизни птиц – Atopobium vaginae, зверей – Mobiluncus spp. и прочих обитателей» [55, 57]. Недавно установлено, что при БВ преобладает массивные структурированные полимикробные биопленки с доминированием G. vaginalis. Такие биопленки окутаны десквамированными вагинальными/препуциальными эпителиальными клетками и секретируются с мочой и спермой. Таким образом, GV-биопленка представляется своеобразным инфекционным агентом, как правило, заражающим партнера другого пола. Сборка отдельных компонентов биопленки является не каждодневным процессом, но, вероятно, эволюционным событием с долгой историей роста, размножения и отбора жизнеспособности и возможности изменить окружающую среду. Монотерапия метронидазолом, моксифлоксацином или местными антисептиками подавляет, но не всегда элиминирует эти биопленки [57].
Канадские авторы провели исследование, в ходе которого изучалось появление плотной бактериальной биопленки, состоящей из лактобацилл в сочетании с другими условно-патогенными микроорганизмами, и влияние метронидазола на биопленки. Исследователи выяснили, что метронидазол не уничтожает условно-патогенные бактерии, формирующие бактериальную биопленку, но способствует образованию в ней отверстий [58]. Уже давно развеян миф о стерильности слизистого слоя матки и маточных труб. Профессор A. Swidsinski установил, что микробные биопленки организуются не только во влагалище, но и в эндометрии и маточных трубах [59]. Причем их обнаружили в соскобах как у беременных, так и у пациенток, обратившихся по поводу других гинекологических заболеваний, потребовавших кюретаж. В результате у 76% женщин в полученном соскобе определялись бактерии. Важно отметить, что у половины женщин, имеющих биопленки во влагалище, биопленки формируются также в эндометрии. Бактерии в матке приобретают особый тропизм: прикрепляются к клеткам просветной поверхности эндометрия, а также адгезируются глубже к ткани желез, богатой питательными веществами секрета. Доказана возможность формирования микробных биопленок и в маточных трубах [60]. Женщины с БВ имеют повышенный риск бактериальной колонизации эндометрия и фаллопиевых труб с отношением шансов 5,7 (95% доверительный интервал – 1,8–18,3; р=0.002). К сожалению, нет уверенности, что нормализация флоры во влагалище как-либо поспособствует ликвидации патологических микробных биопленок в маточных трубах.
Подходы к терапии
Понимание того факта, что микроорганизмы в составе биопленок обретают новые свойства, предполагающие существенное снижение чувствительности к стандартным методам этиотропной терапии, включающей антибиотики, заставляет исследовать все новые способы воздействия. Кратное увеличение дозировок антибактериальных средств малоэффективно, ибо достижение эффективных концентраций в условиях in vivo недостижимо по понятным причинам. Поэтому рассматривается масса подходов, оказывающих влияние на компоненты биопленок с целью снижения уровня их резистентности/целостности с использованием сочетания антибактериальных препаратов [61], антисептиков [62–64], органических кислот [64, 65], солей металлов [66], микробных метаболитов и бактериофагов [67–68], ферментов различного происхождения [69–71]. Перспективными признаются способы воздействия на компоненты матрикса, сигнальные молекулы, факторы адгезии [72].
Использование в качестве адъювантов антимикробной терапии ферментов насчитывает не одно десятилетие [10, 73]. Показана возможность влияния на формирующиеся биопленки с помощью лизоцима, альгинатлиазы, целлюлазы [71], различных протеиназ и их комбинаций [69–70], ДНКазы [74], гиалуронидазы [75]. Примени-тельно к гиалуронидазе (бовгиалуронидазе азоксимеру) использование высокомолекулярного носителя позволило увеличить срок пребывания активного фермента в биологических средах, защитить его от действия антипротеиназ и ингибиторов с сохранением биологической активности [75].
Показано, что 2 часа инкубации бовгиалуронидазы азоксимер в концентрации 750–1500 МЕ/мл вызывает двукратное снижение биомассы матрикса зрелых биопленок E. faecalis и E. coli и на 60% – S. аureus, не влияя на процессы образования бактериальных биопленок. При сочетанном применении с антибактериальными средствами препарат повышает их эффективность в отношении бактерий в составе биопленок. Например, концентрация ципрофлоксацина и амоксициллина, необходимая для уменьшения количества E. faecalis в биопленке на 3 порядка, в присутствии бовгиалуронидазы азоксимера снижается в 16 раз (p
1. Characklis W.G., Cooksey K.E. Biofilms and microbial fouling. Adv Appl Microbial. 1983;29:93–137. Doi: 10.1016/S0065-2164(08)70355-1.
2. Клеточные сообщества. Под ред. Теца В.В. СПб., 1998. 220 с.
3. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленки – город микробов или аналог многоклеточных организмов? Микробиология. 2007;76(2):125–38.
4. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и система регуляции их развития. Генетика. 2004;40(11):1445–56.
5. Тутельян А.В., Юшина Ю.К., Соколова О.В. и др. Образование биологических пленок микроорганизмов на пищевых производствах. Вопросы питания. 2019;88(3):32–43.
6. Stoodley P., Sauer K., Davies D. G., Costerton J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Ann Rev Microbiol. 2002;56:187–209. Doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.160705.
7. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999;284:1318–22. Doi: 10.1126/science.284.5418.1318.
8. Тец В.В., Тец Г.В. Микробные биопленки и проблемы антибиотикотерапии. Атмосфера. Пульмонология и аллергология. 2013;4:60–4.
9. Kiechowski M.R., Horswille A. R. New approaches for treating Staphylococcal biofilm infections. Ann NY Acad Sci. 2011;1241:104–21. Doi: 10.1111/j.1749-6632.2011.06281.x.
10. Кнорринг Г.Ю., Стернин Ю.И., Минаев С.В., Новожилов А.А. Интенсификация антибактериальной терапии при гнойно-воспалительных заболеваниях. Военно-медицинский журнал. 2008;329(10):35–41.
11. Costerton W., Veeh R., Shirtliff M., et al. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Clin Invest. 2003;112:1466–77. doi: 10.1172/JCI20365.
12. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructure of surface film of bacterial colonies. J Gen Microbiol 1993; 137:1081–88. Doi: 10.1099/00221287-139-4-855.
13. Marshag P.A., Loeb G.I., Cowan M.M., Fletcher M. Response of microbial adhesives and biofilm matrix polymers to chemical treatments as determined by interference reflection microscopy and light section microscopy. Appl Environ. Microbiol. 1989;55:2827–31.
14. Tetz V.V. Colony-like communities of bacteria. Microbios. 1994;80(322):63–5.
15. O’Toolе G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann Rev Microbiol. 2000;54:49–79. Doi: 10.1146/annurev.micro.54.1.49.
16. Gristina A.G. Biofilms and chronic bacterial infections. Clin Microbiol Newslett. 1994;16(22):171–76. Doi: //doi.org/10.1016/0196-4399(94)90037-X.
17. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 2002;15:167–93. Doi: 10.1128/cmr.15.2.167–193.2002.
18. Sponza D.T. Investigation of extracellular polymer substances (EPS) and physicochemical properties of different activated sludge flocs under steady-state conditions. Enzyme Microb Technol. 2003;32:375–85.
19. Sutherland I.W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 2001;147:3–9. Doi: 10.1099/00221287-147-1-3.
20. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Маянский Н.А. Матрикс микробных биопленок. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2016;18(1):9–19.
21. Тец Г.В., Артеменко Н.К., Вечерковская М.Ф., Тец В.В. Роль матричных компонентов во взаимодействии бактериофагов с биопленочными бактериями. Практическая пульмонология. 2017;3:55–7.
22. McDougald D., Rice S., Barraud N., et al. Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm dispersal. Nat Rev Microbiol. 2012;10:39–50. Doi: https://doi.org/10.1038/nrmicro2695.
23. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructural features of microbial colony organization. J Basic Microbiol. 1990;30(8):597–607. Doi: 10.1002/jobm.3620300819.
24. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. М.: Боргес, 2002. 432 c.
25. Tetz V.V., Korobov V.P., Artemenko N.K., et al. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities Biofilms. 2004;1:149–55. Doi: 10.1017/S147905050400136X.
26. Chambless J.D., Hunt S.M., Philip S.S. A three-dimensional computer model of four hypothetical mechanisms protecting biofilms from antimicrobials Appl Environmental Microbiol. 2006;72:2005–13. Doi: 10.1128/AEM.72.3.2005-2013.2006.
27. Anderl J.N., Franklin M.J., Stewart P.S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 2000;44:1818–24.
28. Sandoe J.A.T., Wysome J., West A.P., et al. Measurement of ampicillin, vancomycin, linezolid and gentamicin activity against enterococcal biofilms. J Antimicrob Chemother. 2006;57:767–70.
29. Yang Y., Sreenivasan P.K., Subramanyam R., Cummins D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl Environmental Microbiol. 2006;72:6734–42. Doi:10.1128/AEM.01013-06.
30. Pagel M., Simonet V., Li J., Lallemand M., et al. Phenotypic characterization of pore mutants of the Vibrio cholerae рorin OmpU. JBacteriol. 2007;189:8593–600. Doi: 10.1128/JB.01163-07.
31. Mandsberg L.F., Ciofu O., Kirkby N., et al. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa strains with increased mutation frequency due to inactivation of the DNA oxidative repair system. Antimicrob Agents Chemother. 2009;53:2483–91. Doi: 10.1128/AAC.00428-08.
32. Ciofu O. Pseudomonas aeruginosa chromosomal betalactamase in patients with cystic fibrosis and chronic lung infection. Mechanism of antibiotic resistance and target of the humoral immune response. APMIS Suppl. 2003;116:41–7.
33. Yu J., Wu J., Francis K.P., et al. Monitoring in vivo fitness of rifampicinresistant Staphylococcus aureus mutants in a mouse biofilm infection model. J Antimicrob Chemother. 2005;55:528–34. Doi: 10.1093/jac/dki053.
34. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д. и др. Антибиотикорезистентность биоплёночных бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012;4(1):51–8.
35. Тец В.В., Вечерковская М.Ф., Тец Г.В. Споробиота: свойства и роль в патологии человека. Лечебное дело. 2018;4:90–96.
36. Lewis K. Persister cells. Annu Rev Microbiol. 2010;64:357–72. Doi: 10.1146/annurev.micro.112408.134306.
37. Льюис К. Персистирующие клетки и загадка выживания биоплёнок. Биохимия. 2005;70(2):327–36.
38. Плакунов В.К., Стрелкова Е.А., Журина М.В. Персистенция и адаптивный мутагенез в биоплёнках. Микробиология. 2010;79(4):447–58.
39. Harrison J.J., Ceri H., Roper N.J., et al. Persister Cells mediate tolerance to metal oxyanions in Escherichia coli. Microbiology. 2005;151:3181–95. Doi: 10.1099/mic.0.27794-0.
40. Shah K.D., Spoering A.N., Lewis K.K. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol. 2004;186:8172–80. Doi: 10.1128/JB.186.24.8172-8180.2004.
41. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальная биоплёнка как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2011;3:99–109.
42. Dunne W.M. Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin Microbiol Rev. 2002;15:155–66. Doi: 10.1128/cmr.15.2.155-166.2002.
43. Suci P.A., Mittelman M.W., Yu F.P., Geesey G.G. Investigation of ciprofloxacin penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 1994;38:2125–33. Doi: 10.1128/aac.38.9.2125.
44. Amorena B., Gracia E., Monzon M., et al. Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro. J Antimicrob Chemother. 1999;44:43–55. Doi: 10.1093/jac/44.1.43.
45. Zhou G., Shi Q.S., Huang X.M., Xie X.B. The Three Bacterial Lines of Defense against Antimicrobial Agents. Int J Mol Sci. 2015;16(9):21711–33. Doi: 10.3390/ijms160921711.
46. Balcázar J.L., Subirats J., Borrego C.M. The role of biofilms as environmental reservoirs of antibiotic resistance. Front Microbiol. 2015;6:1216. Doi: 10.3389/fmicb.2015.01216.
47. Tetz G.V., Tetz V.V. Introducing the sporobiota and sporobiome. Gut Pathogens. 2017;9:38. Doi: 10.1186/s13099-017-0187-8.
48. McDougald D., et al. Signal-mediated cross-talk regulates stress adaptation in Vibrio species. Microbiology. 2003;149(7):1923–933. Doi: 10.1099/mic.0.26321-0.
49. Williams P. Quorum sensing, communication and crosskingdom signalling in the bacterial world Microbiology. 2007;153:3923–938. Doi: 10.1099/mic.0.2007/012856-0.
50. Mehta P., et al. Information processing and signal integration in bacterial quorum sensing. Mol. Syst Biol. 2009;5:325. Doi: 10.1038/msb.2009.79.
51. Boyle K.E., Heilmann S., van Ditmarsch D., Xavier J.B. Exploiting social evolution in biofilms. Curr Оpin Microbiol. 2013;16(2):207–12. Doi: 10.1016/j.mib.2013.01.003.
52. Verstraelen H., Swidsinski A. The biofilm in bacterial vaginosis: implications for epidemiology, diagnosis and treatment. Curr Opin Infect Dis. 2013;26:86–9. Doi: 10.1097/QCO.0b013e32835c20cd.
53. Swidsinski A., Mendling W., Loening-Baucke V., et al. An adherent Gardnerella vaginalis biofilm persists on the vaginal epithelium after standard therapy with oral metronidazole. Am J Obstet Gynecol 2008;198(1):97e1-6.
54. Patterson J.L., Stull-Lane A., Giererd P.H., Jefferson K.K. Analysis of adherence, biofilm formation and cytotoxicity suggests a greater virulence potential of Gardnerella vaginalis relative to other bacterial-vaginosis – associated anaerobes. Microbiology. 2010;156:392–99.
55. Липова Е.В. Дискуссионные вопросы бактериального вагиноза: взгляд дерматовенеролога. Доктор.Ру. 2015;1(102):30–34.
56. Bradshaw C.S., Morton A.N., Hocking J., et al. High recurrence rates of bacterial vaginosis over the course of 12 months after oral metronidazole therapy and factors associated with recurrence. J Infect Dis. 2006;193(11):1478–86. Doi: 10.1086/503780.
57. Swidsinski A., Loening-Baucke V., Mendling W., et al. Infection through structured polymicrobial Gardnerella biofilms (StPM-GB). Histol Histopathol. 2014;29(5):567–87.
58. McMillan A., Dell M., Zellar M.P., et al. Disruption of urogenital biofilms by lactobacilli. Colloids. Surf B Biointerfaces. 2011;86:58–64.
59. Chen C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature communications. 2017;8(1):875.
60. Swidsinski A., Verstraelen H., Loening-Baucke V., et al. Presence of a polymicrobial endometrial biofilm in patient with bacterial vaginosis. PLoS One. 2013;8(1). doi: 10.1371/journal.pone.0053997.
61. Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2003;2:114–22. Doi: 10.1038/nrd1008.
62. Чекулаев М. В. Воздействие различных химических и биологических факторов на биопленки условно-патогенных микроорганизмов. Наука-2020. 2019;8(33):79–88.
63. Коломойцева Т.Н. Опыт применения препарата Гексикон в терапии смешанных бактериально-грибковых инфекций влагалища. Новые технологии в охране репродуктивного здоровья: Материалы региональной научно-практической конференции. Пермь, 2003. С. 60–61.
64. Кира Е.Ф., Прилепская В.Н, Костава М.Н. и др. Современные подходы к выбору препарата локального действия в терапии бактериального вагиноза. Акушерство и гинекология. 2012;7:59–67.
65. Milani M., Barcellona E., Agnello A. Efficacy of the combination of oral tinidazole and acidic buffering vaginal gel in comparison with vaginal clindamycin alone in bacterial vaginosis: a randomized, inves- tigator-blinded, controlled trial. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2003;109(1):67–71.
66. Campanac C., Pineau L., Payard A., et al. Interactions between Biocide Cationic Agents and Bacterial Biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:1469–74. Doi: 10.1128/aac.46.5.1469-1474.2002.
67. Полыгач О.А., Дабижева А.Н., Ворошилова Н.Н. Влияние композиции литических бактериофагов P. aeruginosa на формирование и разрушение бактериальных биопленок. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018;17(4):20–25
68. Марков А.А., Тимохина Т.Х., Паромова Я.И. Экспериментальное обоснование применения экзометаболитов bifidobacterium bifidum для предотвращения биопленкообразования на поверхности титановых имплантатов с пористым покрытием. Медицинская наука и образование Урала. 2018;19(1
69. Тец В.В., Кнорринг Г.Ю., Артеменко Н.К. и др. Влияние экзогенных протеолитических ферментов на бактерии. Антибиотики и химиотерапия. 2004;49(12):9–13.
70. Тец Г.В., Артеменко Н.К., Заславская Н.В. и др. Влияние экзогенных протеолитических ферментов на передачу плазмидных генов в смешанных бактериальных биоплёнках. Антибиотики и химиотерапия. 2009;54(9–10):3–5.
71. Advances and Future Prospects of Enzyme-Based Biofilm Prevention Approaches in the Food Industry. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 20189;17(6):1484–1502. Doi: 10.1111/1541-4337.12382.
72. Mark D., Becker P., Chatterjee I., et al. Mechanisms of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus functional molecules, regulatory circuits, and adaptive responses. Int J Med Microbiol. 2004;294:203–12. Doi: 10.1016/j.ijmm.2004.06.015.
73. Barsom S., Sasse-Rollenhagen K., Betrmann A. Erfolgreiche Prostatitisbehandlung mit hydrolytischen Enzymen. Erfahrungsheilkunde. 1982;31:2.
74. Тец Г.В., Артеменко К.Л. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии. Антибиотики и химиотерапия. 2006;51(6):3–6.
75. Тризна Е.Ю., Байдамшина Д.Р., Виницкий А.А.,Каюмов А.Р. Влияние in vitro изолированного и сочетанного с антибактериальными средствами применения бовгиалуронидазы азоксимер на целостность бактериальной биопленки и жизнеспособность микроорганизмов. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2020;83(2):38–44.
76. Кузнецова И.В. Ферментные препараты в лечении воспалительных заболеваний у женщин (клинические наблюдения). Эффективная фармакотерапия. 2020;16(7):14–22.
77. Доброхотова Ю.Э., Филатова Л.А., Гришин И.И.Результаты применения бовгиалуронидазы азоксимера в комплексной терапии воспалительных заболеваний органов малого таза. РМЖ. 2018;26(2–1):19–22.
78. Кульчавеня Е.В., Швецова О.П., Бреусов А.А. Обоснование назначения и эффективность препарата лонгидаза у больных хроническим простатитом. Урология. 2018;4:64–71.
79. Баткаев Э.А., Урпин М.В. Совершенствование комплексной терапии хронического бактериального простатита. Вестник последипломного медицинского образования. 2016;1:24–30.